Polarizovaná mikroskopia. Polarizačná mikroskopia. Interferenčná mikroskopia. Luminiscenčná mikroskopia. Mikroskopická technika. Tkanivové kultúry, mikrochirurgia
![Polarizovaná mikroskopia. Polarizačná mikroskopia. Interferenčná mikroskopia. Luminiscenčná mikroskopia. Mikroskopická technika. Tkanivové kultúry, mikrochirurgia](https://i1.wp.com/atm-practica.ru/userfiles/image/shkola/lung1.png)
Polarizačná mikroskopia je jednou z účinných metód na morfologické štúdium štruktúry a vlastností liečiv. Polarizačná mikroskopia umožňuje študovať vlastnosti histologických štruktúr, ktoré sú dvojlomné.
Na implementáciu metódy polarizačnej mikroskopie je možné dodatočne vybaviť akýkoľvek mikroskop. Mikroskop je vybavený dvoma polarizačnými filtrami: prvý je umiestnený priamo pod kondenzorom, druhý je umiestnený medzi šošovkou a okom výskumníka. Otočením polarizátora sa zorné pole stmaví. Liečivo je umiestnené. Otáčajte prípravkom na pódiu, kým sa neobjavia jasne žiariace štruktúry. Žiara sa objaví v momente, keď os dvojlomného objektu zviera s rovinou polarizácie uhol 45°.
Predtým sa na polarizačnú mikroskopiu používali polarizačné filtre s lineárnou polarizáciou. Nová technika skúmala možnosť diagnostiky liekov pomocou polarizačných filtrov s kruhovou polarizáciou. Ukázalo sa, že snímky získané pomocou kruhových filtrov nesú oveľa viac informácií a umožňujú identifikovať jemnejšiu štruktúru tkanív a buniek.
Štúdie polarizovaného svetla sa môžu uskutočňovať na zmrazených alebo parafínových rezoch po deparafinizácii, nezafarbených a zafarbených, uložených v rôznych médiách. Tkanivové bloky by mali byť narezané a orientované tak, aby svalové vlákna požadovanej myokardiálnej vrstvy boli pozdĺžne prerezané.
Myofibrily v polarizovanom svetle vykazujú charakteristické priečne pruhy spojené so striedaním anizotropných (A) a izotropných I - diskov. Disky A majú výrazný pozitívny dvojlom a v polarizovanom svetle sa javia svetlé (v bežnom svetle sú tmavé), zatiaľ čo disky I takmer úplne nemajú dvojlom a v polarizovanom svetle sa javia ako tmavé (v bežnom svetle sú svetlé).
Pomocou polarizačnej mikroskopie je vhodné identifikovať najuniverzálnejšie poškodenie svalových vlákien myokardu a kostrových svalov - poškodenie kontraktúr (porucha priečneho pruhovania kardiomyocytov je jedným zo skorých príznakov poškodenia myofibríl).
Je obvyklé rozlišovať 3 štádiá týchto poškodení:
Stupeň I - anizotropia sa zvyšuje v určitých oblastiach svalových vlákien. II
štádium - A-disky so zvýšenou anizotropiou sa k sebe približujú, v dôsledku čoho sa zmenšuje hrúbka 1-diskov. III
štádium - A-disky sa spájajú do súvislého anizotropného konglomerátu.
Spolu s poraneniami kontraktúry, polarizačná mikroskopia
nám umožňuje identifikovať ďalší typ poškodenia priečne pruhovaných svalových vlákien – hyperrelaxáciu sarkomér, ktorá je do značnej miery charakteristická pre ischémiu myokardu.
Jednoduchosť metódy polarizácie umožňuje pri minimálnych nákladoch dramaticky zvýšiť spoľahlivosť diagnostiky prítomnosti infarktu myokardu.
Čo sa týka polarizačného mikroskopu. Situácia je taká, že z takmer každého mikroskopu sa dá urobiť polarizačný. Používajú sa dva polarizačné filtre (zakúpené vo fotoobchode) - jeden je umiestnený nad iluminátorom a druhý je umiestnený medzi prípravkom a šošovkou.
Bol vytvorený referenčný CD-ROM – „Polarizačná mikroskopia“. Disk obsahuje veľké množstvo prác a materiálov o využití polarizačnej mikroskopie.
Okrem toho bol vytvorený špecializovaný komplex - automatizované forenzné pracovisko. Súčasťou komplexu je polarizačný mikroskop Nikon E200, digitálny fotoaparát s 8 miliónmi prvkov, adaptéry a softvér.
Referencie: 1.
Kaktursky L.V. Polarizačná mikroskopia. V knihe. Mikroskopická technika. - M.: Medicína, 1996. 2.
Cellarius Yu.G., Semenova L.A. Aplikácia polarizačnej mikroskopie na histologickú diagnostiku skorých štádií ischemického a metabolického poškodenia myokardu // Cor et vasa. - 1977 - roč. 19. - č. 1. - str. 28-33 3.
Nepomnyashchikh L.M. Morfogenéza najdôležitejších všeobecných patologických procesov v srdci. - Novosibirsk: Nauka, 1991. - 352 s. 4.
Cellarius Yu.G., Semenova L.A., Nepomnyashchikh L.M. Ohniskové poranenia a infarkt myokardu. Svetelná, polarizačná a elektrónová mikroskopia. - Novosibirsk, 1980.
Viac k téme Koltova N.A. NOVÁ METÓDA POLARIZAČNEJ MIKROSKOPIE NA DIAGNOSTIKU INFARKTU MYOKARDU:
- OTÁZKA 252: Aké nedostatky v odbornej činnosti zdravotníckych pracovníkov sa môžu stať dôvodom na začatie trestného alebo občianskoprávneho konania?
- Kirilov V.A., Bakhmetyev V.I. POUŽITIE MORFOMETRICKEJ METÓDY NA DIAGNOSTIKU TYPU VONKAJŠIEHO VPLYVU MORFOLOGICKÝMI ZNAKMI DEŠTRUKCIE DLHÝCH TRUBKOVÝCH KOSTÍ
- Mishin E.S., Podporinova E.E., Pravodelová A.O. HODNOTENIE METÓD DIAGNOSTIKY POŠKODENÍ HYPOGLOVEJ KOSTI, HRTANU A TRACHY PRI PORANENÍ TUPÉHO KRKU
POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA
POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA
Fyzický encyklopedický slovník. - M.: Sovietska encyklopédia. . 1983 .
POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA
-
pozri čl. Mikroskopia.
Fyzická encyklopédia. V 5 zväzkoch. - M.: Sovietska encyklopédia. Šéfredaktor A. M. Prochorov. 1988 .
Pozrite sa, čo je "POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA" v iných slovníkoch:
POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA- mikroskopia, založená na schopnosti rôznych zložiek buniek a tkanív lámať polarizované lúče. Polarizačný mikroskop možno použiť na skúmanie predmetov, ktoré vykazujú dvojlom... Slovník botanických termínov
Súbor metód (a zariadení poskytujúcich tieto metódy) určených na pozorovanie a štúdium objektov pod mikroskopom, ktoré v akomkoľvek ohľade menia polarizáciu svetla (pozri Polarizácia svetla), ktoré prechádza objektmi... ...
POLARIZAČNÁ MIKROSKOPIA- pozri Mikroskop, Mikroskopická technika... Veterinárny encyklopedický slovník
Všeobecný názov pre metódy pozorovania objektov nerozoznateľných ľudským okom cez mikroskop. Ďalšie podrobnosti nájdete v čl. (pozri MIKROSKOP). Fyzický encyklopedický slovník. M.: Sovietska encyklopédia. Šéfredaktor A. M. Prochorov. 1983... Fyzická encyklopédia
M. pri osvetlení predmetu polarizovaným svetlom; používa sa na detekciu a štúdium objektov alebo ich štruktúr, ktoré majú dvojlomné vlastnosti... Veľký lekársky slovník
Pojem skenovacia sondová mikroskopia Pojem v angličtine skenovacia sondová mikroskopia Synonymá Skratky SPM, SPM Súvisiace pojmy "inteligentné" materiály, mikroskopia atómovej sily, atómová manipulácia, konzola, mikroskop, ... ... Encyklopedický slovník nanotechnológie
Metódy štúdia rôznych objektov pomocou mikroskopu. V biológii a medicíne tieto metódy umožňujú študovať štruktúru mikroskopických objektov, ktorých rozmery sú mimo rozlíšenia ľudského oka. Základom M.m.i. činí ...... Lekárska encyklopédia
- (z gr. ἱστός tkanivo a gr. λόγος poznanie, slovo, veda) časť biológie, ktorá študuje stavbu tkanív živých organizmov. Zvyčajne sa to robí rozrezaním tkaniva na tenké vrstvy pomocou mikrotómu. Na rozdiel od anatómie, ... ... Wikipedia
Mikroskop (z mikro... a grécky skopéo pozerám), optické zariadenie na získavanie veľmi zväčšených obrazov predmetov (alebo detailov ich štruktúry) neviditeľných voľným okom. Ľudské oko je prirodzený optický... Veľká sovietska encyklopédia
I Mikroskop (od Mikro... a grécky skopéo pozerám) optické zariadenie na získavanie veľmi zväčšených obrazov predmetov (alebo detailov ich štruktúry) neviditeľných voľným okom. Ľudské oko je prirodzené... Veľká sovietska encyklopédia
knihy
- Úvod do kvantitatívnej cytochémie. Súhrn kvantitatívnych metód na štúdium buniek a optických zariadení používaných na tento účel. Kniha sa zameriava na najspoľahlivejšie metódy kvantifikácie...
Polarizačná mikroskopia- jedna z vysoko efektívnych metód morfologického výskumu, ktorá má široké možnosti identifikácie biologických štruktúr, čo v kombinácii s dostupnosťou a relatívnou jednoduchosťou určuje jej vysokú hodnotu. Metóda umožňuje študovať nielen histologickú štruktúru liečiva, ale aj niektoré jeho histochemické parametre. V 40-tych a 50-tych rokoch XX storočia. polarizačná mikroskopia bola považovaná za ultraštrukturálnu metódu, pretože umožňovala vidieť ultraštrukturálne schopnosti tkanív.
Polarizačná mikroskopia je určená na štúdium vlastností histologických štruktúr, ktoré majú schopnosť dvojlomu (anizotropie) – štiepenia svetelného lúča pri prechode anizotropným prostredím. Svetelná vlna v anizotropnom prostredí sa rozpadá na dve vlny so vzájomne kolmými rovinami kmitania elektromagnetických vĺn. Tieto roviny sa nazývajú roviny polarizácie. Polarizované svetlo sa líši od bežného (nepolarizovaného) svetla tým, že v druhom menovanom svetelné vlny kmitajú v rôznych rovinách, zatiaľ čo v polarizovanom svetle sa vyskytujú len v určitej rovine.
Na vytvorenie polarizačného efektu používa polarizačný mikroskop dva polaroidy. Prvý, ktorý sa nazýva polarizátor, je umiestnený medzi iluminátorom mikroskopu a histologickou vzorkou. Druhý polaroid, ktorý sa nachádza medzi histologickou vzorkou a okom výskumníka, je analyzátor. Polarizátor aj analyzátor sú opticky úplne rovnaké polarizačné filtre, takže je možné ich zamieňať (ak to konštrukcia mikroskopu umožňuje). Predtým sa na polarizačnú mikroskopiu používali hranoly Nicolas, Arens alebo Thomson vyrobené z islandského nosníka. Tieto hranoly mali obmedzený uhol lomu svetla. V súčasnosti sa namiesto nich používajú ploché polarizačné filtre, produkujúce širokopoľné polarizované svetlo.
Pri vytváraní polarizovaného svetla zohráva rozhodujúcu úlohu relatívna poloha polarizátora a analyzátora vzhľadom na optickú os mikroskopu. Ak sú orientované tak, že obe prepúšťajú polarizované svetlo v rovnakej rovine, t.j. keď sa ich roviny polarizácie zhodujú, oba polarizačné filtre sú schopné prenášať polarizované svetlo; zorné pole mikroskopu je svetlé (obr. 1a).
Ryža. 1 Brightfieldová vzorka ľudských pľúc, OlympusCX41, 10x šošovka
Ak sú polarizačné roviny polarizačných filtrov navzájom kolmé (to sa dosiahne otočením analyzátora o 90° okolo optickej osi mikroskopu), potom polarizované svetlo neprejde a výskumník vidí tmavé zorné pole (obr. 2).
Keď sa polarizátor pri otáčaní otočí o 360°, zorné pole sa dvakrát úplne stmaví a dvakrát sa úplne rozjasní. V minulosti sa používali kompenzačné Bernauerove filtre, ktoré vytvárajú červenkastý odtieň tmavého zorného poľa ( U-TP530 ). Pri použití čiernych zrkadlových filtrov sa stmavené zorné pole nezdá úplne tmavé, ale skôr slabo osvetlené.
Obr. 2 Vzorka ľudských pľúc v polarizovanom svetle, 10x objektív
V prípadoch, keď sa pri skríženej polohe polarizačných filtrov (t.j. pri ortoskopii) v dráhe polarizovaného svetla stretnú anizotropné látky obsiahnuté v histologickej vzorke, tieto látky rozdelia polarizované svetlo na dva lúče so vzájomne kolmými rovinami kmitania svetla. vlny. Svetelné lúče s rovinou vibrácií zhodujúcou sa s rovinou polarizácie prechádzajú cez analyzátor a tie s rovinou kolmou sú odrezané, v dôsledku čoho je intenzita svetelného toku vstupujúceho do oka výskumníka a do kamery len polovičná. intenzitu pôvodného svetelného lúča. V dôsledku opísaných procesov sú anizotropné látky nachádzajúce sa medzi dvoma skríženými polarizátormi viditeľné na tmavom pozadí vo forme svetlých svietiacich predmetov. Zároveň zostávajú tmavé izotropné štruktúry, ktoré nemajú schopnosť dvojlomu.
To tiež ovplyvňuje výber kamery pre polarizačnú mikroskopiu. Keďže úlohou je zachytiť malé jasné signály na tmavom pozadí, zvyčajne kamera pre mikroskopiu vo svetlom poli nemusí stačiť kvôli nízkej citlivosti kamery a veľkému množstvu šumu, ktorý vzniká pri nahrávaní. Pre polarizačnú mikroskopiu Vyžaduje sa mikroskopická kamera s vysokou citlivosťou a presnou reprodukciou farieb. Je vhodnejšie použiť kamery založené na matriciach CCD (, VZ-CC50S), avšak v súčasnej fáze môžete použiť aj lacné verzie kamier založených na matriciach CMOS radu Sony IMX ().
Biologické tkanivá obsahujú dostatočné množstvo anizotropných štruktúr: prvky kontraktilného aparátu svalov, amyloid, kyselina močová, kolagénové formácie, niektoré lipidy, množstvo kryštálov atď.
Svetelné lúče rozdelené v anizotropnom objekte a prechádzajúce cez analyzátor sa vyznačujú nerovnakými rýchlosťami šírenia vĺn. V závislosti od veľkosti tohto rozdielu (nazýva sa aj hodnota oneskorenia svetelného lúča) a v dôsledku rozdielov v absorpcii svetla v analyzátore môže byť žiara anizotropných predmetov biela alebo farebná. V druhom prípade hovoríme o fenoméne dichroizmu ( dvojitá absorpcia ja). Pri štúdiu v polarizovanom poli sú farebné efekty produkované napríklad mnohými kryštálmi.
Proces dvojlomu môže byť posilnený použitím určitých farbív, ktorých molekuly majú schopnosť orientovať sa na anizotropné štruktúry. Histochemické reakcie, ktorých výsledkom je anizotropný efekt, sa nazývajú topooptické reakcie (G. Romhanyi). Existujú dva typy takýchto reakcií - aditívne a inverzné. Pri aditívnych reakciách sa zvyšuje oneskorenie svetelného lúča, čo sa nazýva pozitívna anizotropia, pri inverzných reakciách sa znižuje - negatívna anizotropia.
HARDVÉR A VYBAVENIE
Polarizačná mikroskopia sa vykonáva pomocou špeciálnych polarizačných mikroskopov. Ako príklad môžeme uviesť importované mikroskopy. Väčšina moderných optických mikroskopov je vybavená príslušenstvom pre polarizačnú mikroskopiu.
Na polarizačnú mikroskopiu možno použiť akýkoľvek laboratórny alebo výskumný svetelný mikroskop. Stačí mať dva polarizačné filtre, z ktorých jeden, ktorý pôsobí ako polarizátor, je umiestnený medzi zdrojom svetla a vzorkou a druhý, ktorý hrá úlohu analyzátora, je umiestnený medzi vzorkou a okom výskumníka. Polarizátor môže byť zabudovaný do kondenzátora alebo umiestnený pod ním nad clonou poľa a analyzátor môže byť umiestnený v štrbine v revolveri alebo v medziľahlej vložke.
Na obr. Obrázok 3 zobrazuje schematický diagram polarizačného mikroskopu. Okrem súčastí spoločných pre všetky svetelné mikroskopy má polarizačný mikroskop dva polarizačné filtre (polarizačný, zvyčajne umiestnený pod kondenzorom a analyzátor umiestnený v okulári), ako aj kompenzátor. Analyzátor sa musí otáčať a na určenie stupňa otáčania je potrebná vhodná stupnica.
Polarizačný mikroskop využíva zdroj osvetlenia, ktorý poskytuje vysokú hustotu svetelného lúča. Ako taký zdroj sa odporúča použiť 100 W lampu s napätím 12 V. Pre niektoré typy výskumu je potrebné monochromatické svetlo. Na tento účel sa používa kovový interferenčný filter, ktorý je najlepšie umiestniť nad zrkadlo. Svetlo rozptyľujúce matné sklo je umiestnené pred polarizátorom, t.j. medzi ním a zdrojom svetla, ale v žiadnom prípade nie za polarizátorom, pretože to naruší funkciu polarizačného filtra.
V minulosti sa na polarizačnú mikroskopiu používali achromatické objektívy bez vnútorného napätia, tie sú však v súčasnosti zriedkavé. Dnes sa v polarizačných mikroskopoch používajú iba planárne achromatické objektívy, ktoré nemajú vnútorné napätie. Apochromatické šošovky je možné použiť len v prípadoch, keď sa pri mikrofotografii vyžaduje normálne podanie farieb.
Polarizačné mikroskopy sú vybavené otočným stolíkom, ktorého polohu voči optickej osi je možné meniť. Uhol natočenia stola sa meria pomocou stupňovej stupnice vyznačenej po jeho obvode. Jedným z predpokladov efektívneho využitia polarizačnej mikroskopie je starostlivé vyrovnanie otočného stolíka pomocou centrovacích skrutiek.
Dôležitým prvkom polarizačného mikroskopu je kompenzátor umiestnený medzi objektívom a analyzátorom, zvyčajne v tubuse mikroskopu. Kompenzátor je doska vyrobená zo špeciálnych druhov sadry, kremeňa alebo sľudy. Umožňuje zmerať rozdiel v dráhe delených svetelných lúčov vyjadrený v nanometroch. Fungovanie kompenzátora je zabezpečené jeho schopnosťou meniť rozdiel v dráhe svetelných lúčov, znižovať ho na nulu alebo zvyšovať na maximum. To sa dosiahne otáčaním kompenzátora okolo optickej osi.
MIKROSKOPICKÁ TECHNIKA V POLARIZOVANOM SVETLE
Je vhodnejšie vykonávať polarizačnú mikroskopiu v zatemnenej miestnosti, pretože intenzita svetelného toku vstupujúceho do oka výskumníka je znížená 2-krát v porovnaní s pôvodnou. Po zapnutí iluminátora mikroskopu najskôr dosiahnite čo najjasnejšie osvetlenie zorného poľa otáčaním polarizátora alebo analyzátora. Táto poloha polarizačných filtrov zodpovedá zhode ich rovín polarizácie. Droga je umiestnená na javisku a skúmaná najskôr vo svetlom poli. Potom otáčaním polarizátora (alebo analyzátora) sa zorné pole čo najviac stmaví; táto poloha filtra zodpovedá kolmému usporiadaniu rovín polarizácie. Na odhalenie efektu anizotropie je potrebné spojiť rovinu polarizácie anizotropného objektu s rovinou polarizovaného svetla. Empiricky sa to dosiahne otáčaním stolíka okolo optickej osi. Ak sa na polarizačnú mikroskopiu použije svetelný mikroskop, ktorý nie je vybavený otočným stolíkom, potom sa musí histologická vzorka otáčať manuálne. To je prijateľné, ale v tomto prípade nie je možné vykonať určité typy polarizačnej mikroskopie, ktoré si vyžadujú kvantitatívne hodnotenie (určenie znaku dvojlomu, veľkosti rozdielu v dráhe svetelných lúčov).
Ak sú anizotropné objekty v testovacej vzorke usporiadané (napríklad anizotropné disky priečne pruhovaných svalových vlákien), je vhodné ich študovať v pevnej polohe stolíka, v ktorej tieto objekty poskytujú maximálnu luminiscenciu na tmavom pozadí. . Ak sú anizotropné štruktúry v prípravku chaoticky umiestnené (napríklad kryštály), potom pri ich štúdiu musíte neustále otáčať pódium, aby ste dosiahli žiaru jednej alebo druhej skupiny predmetov.
Na vykonanie hlbšej analýzy a hodnotenia topooptických reakcií je potrebné poznať metodiku stanovenia relatívneho znamienka dvojlomu, veľkosti rozdielu v dráhe lúčov a indexu (koeficientu) lom.
Znak dvojlomu charakterizuje stupeň a smer posunu dráhy svetelných lúčov prechádzajúcich analyzátorom. Tento posun je spôsobený topooptickými farbivami a ak smeruje k zníženiu rozdielu v dráhe lúčov, hovorí o negatívnom znaku dvojlomu ( negatívna anizotropia), ak to pomáha zväčšiť rozdiel v dráhe lúčov, potom sa uvádza pozitívny znak dvojlomu ( pozitívna anizotropia). Ak zmizne rozdiel v dráhe lúčov, efekt anizotropie sa vyrovná.
Znak dvojlomu sa určuje pomocou kompenzátora. Postup pri jeho použití je nasledovný. Sledovaný objekt sa umiestni do polohy, v ktorej sa dosiahne maximálna luminiscencia anizotropných štruktúr v tmavom zornom poli. RI kompenzačná doska sa otáča okolo optickej osi pod uhlom +45° vzhľadom k rovine polarizácie analyzátora. Objekt v závislosti od rozdielu v dráhe svetelných lúčov, ktorý sa môže pohybovať od 20 do 200 nm, získava buď modrú alebo žltú farbu. V prvom prípade je znak dvojlomu pozitívny, v druhom - negatívny. Treba mať na pamäti, že v prípade, že je kompenzátor umiestnený pod uhlom +45°, má celkové pozadie tmavého zorného poľa červený odtieň.
Možno použiť aj kompenzátor λ/4 (U-TP137). Postup pri jeho použití je rovnaký, len zorné pole má skôr sivý než červený odtieň a objekt žiari s pozitívnym znakom lomu a je stmavený s negatívnym znakom.
Kvantitatívne stanovenie rozdielu v dráhe svetelných lúčov, vyjadrené v nanometroch, sa uskutočňuje pomocou kompenzátora Braque Köhler. Ak to chcete urobiť, použite vzorec:
Γ=Γλ×sinφ
kde λ je konštanta vyznačená na kompenzátore výrobcom, φ je uhol natočenia kompenzátora voči rovine polarizácie analyzátora.
Index lomu anizotropného objektu sa určuje jeho porovnaním (pod mikroskopom) s testovaným objektom umiestneným vedľa neho. Ako skúšobné objekty sa používajú štandardné kvapaliny so známym indexom lomu. Predmet a vzorka sú umiestnené vedľa seba na javisku. Keď sa ich indexy lomu nezhodujú, medzi objektom a vzorkou je viditeľná svetlá čiara nazývaná Beckova čiara. Zdvihnutie tubusu mikroskopu vzhľadom na zaostrenú polohu spôsobí posun Beckovej línie smerom k médiu, čo dáva výraznejší efekt lomu. Keď sa indexy lomu objektu a vzorky zhodujú, Beckova čiara zmizne. Index lomu sa zvyčajne určuje v monochromatickom svetle pre sodíkovú čiaru spektra (pri vlnovej dĺžke 589 nm a teplote 20 ° C). Lom by sa mal určiť pre dve navzájom kolmé roviny polarizácie. Na tento účel sa analyzátor vyberie a lom objektu sa zaznamená v jeho dvoch vzájomne kolmých polohách. Rozdiel medzi oboma indexmi lomu (ng - nk) charakterizuje silu lomu.
VLASTNOSTI SPRACOVANIA MATERIÁLU A PRÍPRAVY PRÍPRAVKOV
Fixačný materiál pre polarizačnú mikroskopiu v kyslom formalíne je nežiaduci, pretože formalínový pigment vytvorený interakciou tkanivového hemoglobínu s kyslým formaldehydom má anizotropné vlastnosti a sťažuje štúdium preparátov v polarizovanom svetle. G. Scheuner a J. Hutschenreiter (1972) odporúčajú na tento účel použiť 10 % neutrálny formalín, Bakerov kalcium-formolový roztok a Carnoyovu kvapalinu.
Doba fixácie v 10% neutrálnom formalíne je 24 - 72 hodín pri 4 °C, v Bakerovom kalcium-formolovom roztoku - 16 - 24 hodín pri 4 °C. Fixácia v kalcium-formole je obzvlášť výhodná pri štúdiu lipid-proteínových zlúčenín. Carnoyova tekutina rýchlo saturuje látky. Diely s hrúbkou 1 - 2 mm je možné profilovať už po 1 hodine pri teplote 4 °C. Fixácia v Carnoyovej tekutine nie je vhodná na lipidové štúdie. Okrem toho sa používa Zenkerova kvapalina, najmä ak je impregnovaná soľami zlata a striebra. Po ošetrení zmesou Zenkerovej tekutiny a kyseliny octovej získajú červené krvinky schopnosť dvojlomu.
Pri skúmaní hustých tkanív (kosti, zuby) v polarizačnom mikroskope je okrem kyslého odvápnenia potrebné ďalšie spracovanie na odstránenie kolagénových vlákien. Na tento účel sa rezy takýchto tkanív varia niekoľko minút v zmesi glycerínu a hydroxidu draselného (10 ml glycerínu a 2 zrnká hydroxidu draselného), kým úplne nezbelejú, potom sa alkália opatrne scedí, rez sa premyje vodou a prenesené pinzetou na stolík mikroskopu.
Pre polarizačnú mikroskopiu sa používajú parafínové, zmrazené a kryostatické rezy. Nezafarbené zmrazené rezy na vyšetrenie pod polarizovaným svetlom sa vložia do glycerolu. Nefixované rezy kryostatu sú vhodné na polarizačnú mikroskopickú analýzu ihneď po príprave. Vzhľadom na ich vysokú citlivosť na škodlivé účinky rôznych environmentálnych faktorov sa tieto rezy stále odporúčajú fixovať v 10% neutrálnom formaldehydovom alebo vápenato-formolovom roztoku.
Výsledky polarizačnej mikroskopie sú ovplyvnené hrúbkou histologických rezov. Pri štúdiu hrubých rezov sa vytvárajú podmienky pre superpozíciu rôznych anizotropných štruktúr na seba. Okrem toho sa pri rôznych hrúbkach rezov môžu meniť anizotropné vlastnosti skúmaných štruktúr, preto je veľmi dôležité, najmä pri porovnávacích štúdiách, zabezpečiť konštantnú hrúbku rezu. Odporúčaná maximálna hrúbka rezu by nemala presiahnuť 10 µm.
Ďalšou povinnou podmienkou je starostlivé odparafínovanie rezov, pretože neodstránené zvyšky parafínu poskytujú výrazný anizotropný účinok, čo komplikuje štúdiu. Parafín zostáva obzvlášť dlho na červených krvinkách a bunkových jadrách. Na úplné odstránenie parafínu z rezov sa odporúča vykonať nasledujúce spracovanie.
- xylén 30 min
- Alkohol 100% 5 min
- Zmes metanolu a chloroformu (1:1) pri 50 °C počas 24 hodín
- Alkohol 100% 5 min
- Alkohol 70% 10 min Voda
Malo by sa tiež pamätať na to, že rezy, ktoré sa podrobia polarizačnej mikroskopii, by nemali prísť do kontaktu s fenolmi (napríklad by sa nemali čistiť v karbolickom xyléne).
Podrobnejšie informácie o polarizačnej mikroskopii a použití kompenzátorov možno získať z odkazu (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Ak máte akékoľvek otázky týkajúce sa polarizačnej mikroskopie, kontaktujte Školu mikroskopu.
Metóda fázovej kontrastnej mikroskopie
Väčšina bunkových štruktúr sa len málo líši v indexe lomu svetla a absorpcii lúčov navzájom a prostredím. Na štúdium takýchto komponentov je potrebné zmeniť osvetlenie (so stratou jasnosti obrazu) alebo použiť špeciálne metódy a nástroje. Jednou z nich je metóda mikroskopie s fázovým kontrastom. Je široko používaný pri životne dôležitých štúdiách buniek. Podstatou metódy je, že aj pri veľmi malých rozdieloch v indexoch lomu rôznych prvkov prípravku prechádza svetelná vlna cez ne rôzne fázové zmeny. Tieto fázové zmeny, neviditeľné priamo okom alebo fotografickou doskou, sa pomocou špeciálneho optického zariadenia premieňajú na zmeny amplitúdy svetelnej vlny, t. j. na zmeny jasu, ktoré sú už okom viditeľné alebo zaznamenané na fotocitlivom zariadení. vrstva. Vo výslednom viditeľnom obraze rozloženie jasu (amplitúda) reprodukuje fázový reliéf. Takto získaný obraz sa nazýva fázový kontrast. Objekty sa môžu zdať tmavé na svetlom pozadí (pozitívny fázový kontrast) alebo svetlé na tmavom pozadí (negatívny fázový kontrast).
Metóda interferenčného kontrastu (interferenčná mikroskopia)
Metóda interferenčného kontrastu je podobná predchádzajúcej – obe sú založené na interferencii lúčov prechádzajúcich mikročasticou a prechádzajúcich ňou. Lúč paralelných svetelných lúčov z iluminátora sa pri vstupe do mikroskopu rozdvojuje na dva prúdy. Jeden z výsledných lúčov smeruje cez pozorovanú časticu a získava zmeny vo fáze oscilácie, druhý - obchádza objekt pozdĺž rovnakej alebo ďalšej optickej vetvy mikroskopu. V okulárovej časti mikroskopu sú oba lúče opäť spojené a navzájom sa rušia. V dôsledku interferencie sa vytvorí obraz, v ktorom sa oblasti bunky s rôznou hrúbkou alebo rôznou hustotou budú navzájom líšiť v stupni kontrastu. Metóda interferenčného kontrastu sa často používa v spojení s inými mikroskopickými metódami, najmä s pozorovaním v polarizovanom svetle. Jeho použitie v kombinácii s ultrafialovou mikroskopiou umožňuje napríklad určiť obsah nukleových kyselín v celkovej sušine predmetu.
Polarizačná mikroskopia
Polarizačná mikroskopia je metóda pozorovania predmetov, ktoré sú izotropné, teda v polarizovanom svetle. usporiadaná orientácia submikroskopických častíc. Pred kondenzorom polarizačného mikroskopu je umiestnený polarizátor, ktorý prenáša svetelné vlny so špecifickou rovinou polarizácie. Za preparátom a objektívom sa umiestni analyzátor, ktorý dokáže prenášať svetlo s rovnakou rovinou polarizácie. Ak sa potom analyzátor otočí o 90° vzhľadom na prvý, neprenikne cez neho žiadne svetlo. V prípade, že sa medzi takýmito skríženými hranolmi nachádza predmet, ktorý má schopnosť polarizovať svetlo, bude viditeľný ako žiariaci v tmavom poli. Pomocou polarizačného mikroskopu možno overiť napríklad orientované usporiadanie miciel v bunkovej stene rastlín.
Povedzme, že máte rozbité polarizačné okuliare (polarizátory). Ak vezmete jeden pohár a otočíte ho vzhľadom na druhý, dostanete tmu. Stupeň nepriehľadnosti závisí od kvality polarizátorov.
Potlačenie 95-98% svetla je vynikajúce; ak je oveľa menšie, objaví sa špinavý sivý odtieň Relatívna poloha polarizátorov pri získaní tmavého poľa sa nazýva prekrížené, pri získaní najsvetlejšej nuly - rovnobežka.
Predtým, ako prejdeme k polarizačnej mikroskopii, vráťme sa k vyššie spomínanému patológovi.
K jeho mikroskopu s jasným poľom alebo fázovým kontrastom pridajme medzi binokulárny nástavec a telo mikroskopu zariadenie, ktoré umožní zavedenie polarizačného prvku (analyzátora) do optickej dráhy. Umiestnime ďalší polarizačný prvok (polarizátor) pod kondenzor a otáčame ním, až kým nie je úplná tma (analyzátor a polarizátor sú skrížené); Opravme ich polohu. Vložme do tohto prístroja (medzi binokulárny nástavec a telo mikroskopu) výsuvný držiak s kompenzátorom - červenú doštičku prvého rádu. Povedzme, že patológ skúma vzorku tkaniva a všimne si predmet, ktorý vyzerá ako kryštál. Nainštaluje analyzátor, otočí polarizátor do skríženej polohy a skúma predmet. Ak ide o kryštál alebo kryštalický útvar, potom svieti, ako keby sa za priesvitnou clonou rozsvietilo svetlo. Patológ zatiaľ nevie určiť, či ide o kryštál kyseliny močovej alebo vápnika. Zavedie do priebehu lúčov červenú dosku prvého rádu a otočí ju z jednej nastavenej polohy do druhej: kryštál sa zmení na červený alebo zelený. Týmto spôsobom možno určiť povahu kryštálu. Potom patológ odstráni analyzátor a ak je to potrebné, polarizátor z optickej dráhy a pokračuje v práci (študovaná oblasť vzorky zostáva v zornom poli).
Teraz obráťme našu pozornosť na polarizačný mikroskop. Zahŕňa veľa komponentov, ktoré sú prítomné v bežnom mikroskope s jasným poľom, pretože zahŕňa skúmanie preparátu v jasnom poli medzi polarizačnými prvkami.
Pomerne často, najmä pri výučbe študentov, sa používajú monokulárne polarizačné mikroskopy kvôli ich nízkej cene. Profesori preferujú binokulárne modely. Binokulárna hlavica môže byť vybavená buď pevnou alebo zaostrovacou Bertrandovou šošovkou, potrebnou pre výskum
(jej funkcie sú popísané nižšie). Medzi tryskou a telom je časť, v ktorej je umiestnený analyzátor, a štrbina na inštaláciu kompenzátora.
Mikroskop má okrúhly a otočný stolík, ktorý vám umožňuje skúmať preparát otáčaním medzi krížovým analyzátorom a polarizátorom. Stôl je vybavený aj stupnicou na meranie jeho natočenia v stupňoch a oblúkových minútach. Pod stolíkom na objekt (zvyčajne pod kondenzorom) sa nachádza otočný polarizátor s pevnou polohou 0, 45° a 90° k polohe analyzátora. Mikroskop je samozrejme vybavený apertúrnou clonou a spravidla aj držiakom filtra.
Okulár mono- alebo binokulárneho nástavca má nitkový kríž. Celé centrovanie sa vykonáva vzhľadom na tento nitkový kríž, príprava sa tiež otáča okolo stredu tohto nitkového kríža.
Rozdiel medzi mechanickým stolíkom je v tom, že musí byť nízky, aby doň pri otáčaní nenarážali šošovky. Veľmi často ide o merací stôl, ktorý sa pri pohybe v smere východ-západ alebo sever-juh postupne fixuje v určených intervaloch. Predstavte si guľu, ktorá spadne do drážky – takto funguje fixačný mechanizmus. Môžete si vziať predmet ostrejší ako lopta - efekt bude rovnaký. Keď šošovky otáčate, blokovací mechanizmus drží každú šošovku v optickej dráhe lúčov.
Na počítanie rôznych komponentov na tenkom plátku sú im priradené čísla na počítadle od 1 do 9. Číslo 10 je pre emisie alebo súčet. Výskumník pohybuje prípravkom, kým nie je stôl upevnený, a pozerá sa, či je jeden z 9 komponentov na zameriavacom kríži. Ak tam žiadna z nich nie je, vyberte číslo 10. Pri počítaní materiálu na pulte je potrebné uviesť číslo každej zložky a všetko ostatné na čísle 10. Po prezretí celej prípravy si môžete vypočítať percento ktorúkoľvek z 9 zložiek materiálu.
Kompenzátor je inštalovaný v mikroskope pod uhlom 45° v smere sever-juh a východ-západ.
Väčšina komponentov je viditeľná rovnako bez ohľadu na to, ako sú umiestnené vo vzťahu ku kompenzátoru, ale niektoré vyžadujú rotáciu, čo je ďalší dôvod, prečo musí byť stolík otočný. Nebudeme sa podrobne zaoberať funkciami rôznych dilatačných škár alebo klinov, pretože na túto tému si môžete zakúpiť špeciálnu knihu. Spomenieme len niektoré názvy: doska 1/4 vlnovej dĺžky - kremenný klin, ktorý môže mať 6, 30 alebo 120 rádov; červená platňa prvého rádu (má tri ďalšie názvy na označenie veku tých, ktorí ich používajú: platňa s pomalým svetlom, platňa s citlivým tónom a sadrová platňa, najstaršia).
Uvažujme o koncepte „poriadku“. Keď sa svetlo láme cez hranol, všetky farby spektra sa stanú viditeľnými, potom sa stanú bledšími (tretia, štvrtá atď. sady poradia farieb). Nultého rádu je čierne svetlo na samom začiatku spektra. Červená doska prvého rádu, ako už názov napovedá, je ekvivalentná červenej v prvom poradí farieb.
Bertrandova šošovka v kombinácii s okulárom poskytuje pomocný zameriavací tubus, ktorý umožňuje pozorovať interferenčné obrazce vo výstupnej pupile mikrošošovky, zatiaľ čo samotný mikroskop je zaostrený na špecifické zrno preparátu. Ak geológ potrebuje identifikovať materiál, otáča tenkú časť minerálu medzi skríženým polarizátorom a analyzátorom. V tomto prípade sú viditeľné 2 farby (a iba 2) a na premenu jednej farby na druhú je potrebný špecifický uhol natočenia prípravku. Väčšina minerálov sa dá identifikovať týmto spôsobom. Niektoré minerály sú však tak podobné vo farbe a uhloch rotácie, že interferenčné obrazce sú jediným spôsobom, ako ich identifikovať.
Petrografia študuje geológiu ropy. Petrografický mikroskop nemá Bertrandovu šošovku, pretože jeho používatelia nepotrebujú interferenčný obrazec.
Na tenkých rezoch sa vykonávajú štandardné geologické práce. Pozostáva z tenkej časti kameňa, brúsenej, namontovanej v epoxidovej živici na podložnom skle 1 x 2 palce a potom opäť brúsenej tak, aby hrúbka časti nepresahovala 15 mikrónov; Potom sa prípravok umiestni na pódium a prikryje krycím sklíčkom. Takéto prípravky sa pozorujú vo svetle prichádzajúcom z polarizátora cez tenký rez.
Všetky takéto štúdie sa týkajú mikroskopu s jasným poľom, ku ktorému je pridaný polarizátor, analyzátor a kompenzátor.
Prieskumník rúd môže začať pripravovať vzorku rovnakým spôsobom ako tenký rez tak, že vytvorí hrúbku 6-10 mm a povrch obrúsi. Bude to vyžadovať epiilumináciu, preto musí byť medzi binokulárnu hlavu a telo mikroskopu umiestnený iluminátor. Bude tam žiarovka aj transformátor; polarizátor, analyzátor, kompenzátor; apertúrne a poľné clony, dichroické zrkadlo atď. d.
Polarizované svetelné šošovky fungujú inak ako štandardné šošovky. Hlavná vec je, že musia byť bez vnútorného napätia. K napätiu v šošovkách dochádza v dôsledku tlačenia kovových rámov na okraje šošovky. Pri pozorovaní mikroskopom sa to javí ako záblesk bieleho svetla vychádzajúceho z tlakového bodu smerom k stredu.
Výrobcovia starostlivo kontrolujú šošovky na vnútorné napätie. Tie šošovky, ktoré nemajú napätie, sú dodávané s polarizačnými mikroskopmi za vysokú cenu; a šošovky s napätím sú zahrnuté v biologických mikroskopoch, v ktorých napätie nehrá žiadnu úlohu, alebo sú úplne odmietnuté.
Ukázali sme vám potrebu našich šošoviek. Tieto objektívy sú navrhnuté a upravené na prácu so vzorkami pod krycími sklíčkami s hrúbkou 0,17 mm.
Pri skúmaní rudy pod mikroskopom nie je vyleštený povrch prekrytý krycím sklíčkom. Na takúto prácu potrebujeme šošovky, ktoré sa nebudú nastavovať vzhľadom na krycie sklíčka, prípadne šošovky pre metalografiu, ale bez napätia.
Objektívy 10x možno použiť s krycími sklíčkami alebo bez nich. Mikroskopy na rudy budú vyžadovať 20x alebo silnejšie objektívy, ktoré sú korigované na absenciu krycieho sklíčka.
Náš štandardný polarizačný mikroskop sa zvyčajne dodáva s objektívmi 5x, 10x a 40x. Revolver má 4 objímky na šošovky, preto sme pridali druhú šošovku 40x na diapozitívy bez krycieho sklíčka, čím sme vytvorili duálny svetelný polarizačný mikroskop. Predtým, keď sme opisovali okuláre Huygens, v poznámke bolo povedané, že neposkytujú korekciu farieb ani kompenzáciu chromatickej aberácie a na vyriešenie tohto problému by ste si mali prečítať časť „Polarizačná mikroskopia“.
Keď už sme sa rozhodli pre význam farieb, nechceme, aby okulár alebo šošovka produkovali v zornom poli farby, ktoré do prípravku nepatria. Vieme, že šošovky bez napätia boli vybrané pre polarizačné mikroskopy kvôli ich nedostatku napätia a korekcie farieb. Preto je veľmi dôležité, aby aj okuláre boli bez korekcie farieb či kompenzácie. Z tohto dôvodu sa polarizačné okuláre zvyčajne upravujú na okuláre Huygens. Niekedy sa používajú aj širokouhlé okuláre, ale špeciálne testované na zhodu s polarizačným mikroskopom.
Buďte opatrní pri výpočte celkového zväčšenia polarizačného mikroskopu. Vzhľadom na výšku zariadenia použitého na pripevnenie analyzátora a kompenzátora došlo k ďalšiemu zvýšeniu binokulárneho nástavca. Napríklad mikroskop vybavený revolverom pre 3 šošovky má dodatočné zväčšenie 1,4x a mikroskop s revolverom pre 4 šošovky má dodatočné zväčšenie 1,8x.
Na obr. Obrázok 10 zobrazuje celkový pohľad na polarizačný mikroskop.
1. 10x širokouhlý okulár s dlhým očným reliéfom
2. Bertrandova šošovka
3. Slot pre kompenzátor
4. Mikrošošovky bez napätia
5. Otočný stolík so stupnicou na číselníku; cena delenia 1°
6. Kondenzátor
7. Rotačný polarizátor so schopnosťou odoberať lúče z dráhy
8. Poľná clona
9. Zaostrovací 10x okulár s vodidlom a nitkovým krížom
10. Binokulárna hlava s 360° rotáciou a 30° uhlom sklonu k optickej osi
11. Skrutka na pripevnenie ďalekohľadu
12. Držiak analyzátora
13. Revolver s mikrošošovkami
14. Stojan na mikroskop
15. Spony na držiaky liekov
16. Nastavovač na nastavenie výšky držiaka kondenzora
17. Koaxiálne umiestnené mechanizmy hrubého a jemného zaostrovania
18. Podstavec mikroskopu so zabudovaným transformátorom a nastavením jasu 6 V, 30 W halogénovej žiarovky.