Polarizovaná mikroskopia. Vizualizácia vnútrobunkových štruktúr mikroorganizmov pomocou svetelnej mikroskopie. Metóda fázovej kontrastnej mikroskopie
Polarizačná mikroskopia umožňuje získať obrázky nezafarbených anizotropných štruktúr (napríklad kolagénové vlákna, myofibrily alebo mikrobiálne bunky). Princíp metódy je založený na štúdiu objektu vo svetle tvorenom dvoma lúčmi polarizovanými vo vzájomne kolmých rovinách.
Ryža. 11-4. Schéma fluorescenčného mikroskopu.Interferenčná mikroskopia
Interferenčná mikroskopia spája princípy fázovo-kontrastnej a polarizačnej mikroskopie. Metóda sa používa na získanie kontrastného trojrozmerného obrazu nenatretých predmetov. Princíp metódy je založený na štiepení svetelného toku v mikroskope; jeden lúč prechádza objektom, druhý - okolo neho. Oba lúče sú spojené v okuláre a navzájom sa rušia.
Ryža. 11-5. Priama imunofluorescencia. Priama metóda zahŕňa použitie AT značeného fluorescenčným farbivom na predmetný Ag; AT interaguje s Ag v miestach ich lokalizácie, čo umožňuje vizualizáciu značky.
Fluorescenčná mikroskopia
Metóda fluorescenčnej mikroskopie na základe schopnosti niektorých látok žiariť pri vystavení krátkovlnnému žiareniu. V tomto prípade sú emitované svetelné vlny dlhšie ako vlna, ktorá spôsobuje žiaru. Inými slovami, fluorescenčné objekty absorbujú svetlo jednej vlnovej dĺžky a vyžarujú svetlo v inej oblasti spektra (obr. 11-4). Napríklad, ak je indukujúce žiarenie modré, potom môže byť výsledná žiara červená alebo žltá. Tieto látky (fluoresceín izokyanát, akridínová oranž, rodamín atď.) sa používajú ako fluorescenčné farbivá na pozorovanie fluorescenčných (luminiscenčných) objektov. Vo fluorescenčnom mikroskope svetlo zo zdroja (ultravysokotlaková ortuťová výbojka) prechádza cez dva filtre.
Ryža. 11-6. Nepriama imunofluorescencia. Nepriama metóda zahŕňa použitie dvoch rôznych AT. Prvé AT reagujú s Ag mikroorganizmu, druhé AT (spojené so značkou) špecificky interagujú s prvými AT, ktoré sú Ag pre druhé AT. Metóda je oveľa citlivejšia ako priama imunofluorescencia, pretože niekoľko molekúl druhého AT sa viaže na každú molekulu prvého AT.
Prvý (modrý) filter zachytáva svetlo pred vzorkou a prenáša svetlo s vlnovou dĺžkou, ktorá excituje fluorescenciu vzorky. Druhá (žltá) blokuje modré svetlo, ale prepúšťa žlté, červené a zelené svetlo vyžarované fluorescenčným objektom a vnímané okom. Typicky sa skúmané mikroorganizmy farbia priamo alebo pomocou AT alebo lektínov značených fluorochrómmi. Lieky interagujú s Ag alebo inými ligand viažucimi štruktúrami objektu. Fluorescenčná mikroskopia našiel široké uplatnenie na vizualizáciu výsledkov imunochemických reakcií založených na špecifickej interakcii AT značeného fluorescenčnými farbivami s Ag študovaného objektu. možnosti imunofluorescenčné reakcie sú uvedené na obr. 11-5 a 11-6.
Odoslanie dobrej práce do databázy znalostí je jednoduché. Použite nižšie uvedený formulár
Študenti, postgraduálni študenti, mladí vedci, ktorí pri štúdiu a práci využívajú vedomostnú základňu, vám budú veľmi vďační.
Uverejnené dňa http://www.allbest.ru/
Úvod
Svetelná mikroskopia
Elektrónová mikroskopia
Polarizačná mikroskopia
Príloha 1
Svetelná mikroskopia
Svetelná mikroskopia je najstaršia a zároveň jedna z najbežnejších metód na štúdium a štúdium rastlinných a živočíšnych buniek. Predpokladá sa, že začiatok štúdia buniek bol práve s vynálezom svetelného optického mikroskopu. Hlavnou charakteristikou svetelného mikroskopu je rozlišovacia schopnosť svetelného mikroskopu, ktorá je určená vlnovou dĺžkou svetla. Hranica rozlíšenia svetelného mikroskopu je určená vlnovou dĺžkou svetla, optický mikroskop sa používa na štúdium štruktúr, ktoré majú minimálne rozmery rovné vlnovej dĺžke svetelného žiarenia. Mnohé základné bunky majú podobnú optickú hustotu a vyžadujú predbežnú úpravu pred mikrokopírovaním, inak sú pod bežným svetelným mikroskopom prakticky neviditeľné. Na ich zviditeľnenie sa používajú rôzne farbivá s určitou selektivitou. Pomocou selektívnych farbív je možné podrobnejšie študovať vnútornú štruktúru bunky.
Napríklad:
hematoxylínové farbivo farbí niektoré zložky jadra modro alebo fialovo;
po postupnom ošetrení floroglucinolom a potom kyselinou chlorovodíkovou sa lignifikované bunkové membrány stanú čerešňovočervenými;
Farbivo Sudan III farbí suberizované bunkové membrány do ružova;
slabý roztok jódu v jodide draselnom sfarbí škrobové zrná do modra.“
Pri vykonávaní mikroskopických vyšetrení sa väčšina tkanív pred farbením fixuje.
Po fixácii sa bunky stanú priepustnými pre farbivá a bunková štruktúra sa stabilizuje. Jedným z najbežnejších fixačných prostriedkov v botanike je etylalkohol.
Pri príprave prípravku na mikrokopírovanie sa na mikrotóme zhotovujú tenké rezy (príloha 1, obr. 1). Toto zariadenie využíva princíp krájača chleba. Pre rastlinné tkanivá sa vyrábajú o niečo hrubšie rezy ako pre živočíšne, pretože rastlinné bunky sú relatívne väčšie. Hrúbka rezov rastlinného tkaniva pre - 10 mikrónov - 20 mikrónov. Niektoré papierové vreckovky sú príliš mäkké na to, aby sa dali rovno odrezať. Preto sa po fixácii nalejú do roztaveného parafínu alebo špeciálnej živice, ktorá nasýti celú tkaninu. Po vychladnutí sa vytvorí pevný blok, ktorý sa následne rozreže pomocou mikrotómu. Vysvetľuje to skutočnosť, že rastlinné bunky majú silné bunkové steny, ktoré tvoria tkanivový rámec. Lignifikované škrupiny sú obzvlášť silné.
Pri použití náplne pri príprave hrozí riziko poškodenia bunkovej štruktúry, aby ste tomu zabránili, použite metódu rýchleho zmrazenia. Pri použití tejto metódy môžete urobiť bez upevnenia a plnenia. Zmrazené tkanivo sa reže pomocou špeciálneho mikrotómu – kryotómu (Príloha 1, Obr. 2).
Zmrazené časti lepšie zachovávajú prirodzené štrukturálne prvky. Sú však náročnejšie na varenie a prítomnosť ľadových kryštálikov kazí niektoré detaily.
fázovo-kontrastné (Príloha 1, Obr. 3) a interferenčné mikroskopy (Príloha 1, Obr. 4) umožňujú skúmať živé bunky pod mikroskopom s jasným prejavom detailov ich štruktúry. Tieto mikroskopy využívajú 2 lúče svetelných vĺn, ktoré sa navzájom ovplyvňujú (superponujú), čím sa zvyšuje alebo znižuje amplitúda vĺn vstupujúcich do oka z rôznych zložiek bunky.
Svetelná mikroskopia má niekoľko odrôd.
Metóda svetlého poľa a jej odrody
Metóda prepusteného svetelného poľa používa sa pri štúdiu priehľadných prípravkov s obsahom častíc a detailov absorbujúcich svetlo (tenké farebné rezy živočíšnych a rastlinných tkanív, tenké rezy minerálov). V neprítomnosti liečiva vytvára lúč svetla z kondenzora, prechádzajúci cez šošovku, rovnomerne osvetlené pole v blízkosti ohniskovej roviny okuláru. Ak sa v prípravku nachádza absorpčný prvok, dochádza k čiastočnej absorpcii a čiastočnému rozptylu svetla naň dopadajúceho, čo spôsobuje vzhľad obrazu. Metódu je možné použiť aj pri pozorovaní nepohlcujúcich predmetov, avšak len vtedy, ak rozptyľujú osvetľujúci lúč tak silno, že jeho podstatná časť nedopadne do objektívu.
Spôsob šikmého osvetlenia- variácia predchádzajúcej metódy. Rozdiel medzi nimi je v tom, že svetlo smeruje na objekt pod veľkým uhlom k smeru pozorovania. Niekedy to pomáha odhaliť „reliéf“ objektu v dôsledku vytvárania tieňov.
Metóda jasného poľa v odrazenom svetle používa sa pri štúdiu nepriehľadných predmetov odrážajúcich svetlo, ako sú tenké časti kovov alebo rúd. Prípravok je osvetlený (z iluminátora a priesvitného zrkadla) zhora cez šošovku, ktorá súčasne plní úlohu kondenzora. Na obrázku vytvorenom v rovine šošovkou spolu s tubusovou šošovkou je viditeľná štruktúra prípravku v dôsledku rozdielu v odrazivosti jeho prvkov; Vo svetlom poli vyniknú aj nehomogenity, ktoré rozptyľujú na ne dopadajúce svetlo.
Metóda tmavého poľa a jej variácie
Metóda prenášaného svetla a tmavého poľa používa sa na získanie snímok priehľadných, neabsorpčných predmetov, ktoré nie je možné vidieť pomocou metódy jasného poľa. Často sú to biologické objekty. Svetlo z iluminátora a zrkadla smeruje na prípravok špeciálne navrhnutým kondenzorom - tzv. kondenzátor tmavého poľa. Hlavná časť svetelných lúčov, ktorá pri prechode cez priehľadný prípravok na výstupe z kondenzora nemenila svoj smer, vytvára lúč vo forme dutého kužeľa a nevstupuje do šošovky (ktorá sa nachádza vo vnútri tohto kužeľa). . Obraz v mikroskope je tvorený len pomocou malej časti lúčov rozptýlených mikročasticami liečiva umiestnenými na sklíčku do kužeľa a prechádzajúcich šošovkou. V zornom poli na tmavom pozadí sú viditeľné svetlé obrazy štruktúrnych prvkov liečiva, ktoré sa od okolitého prostredia líšia indexom lomu. Veľké častice majú len svetlé okraje, ktoré rozptyľujú svetelné lúče. Pomocou tejto metódy nie je možné podľa vzhľadu obrazu určiť, či sú častice priehľadné alebo nepriehľadné, alebo či majú vyšší alebo nižší index lomu v porovnaní s okolitým prostredím.
Elektrónová mikroskopia
Prvý elektrónový mikroskop skonštruovali v roku 1931 Knoll a Ruska v Nemecku. Až v 50. rokoch boli vyvinuté metódy na výrobu profilov s potrebnými vlastnosťami.
Ťažkosti elektrónovej mikroskopie spočívajú v tom, že na štúdium biologických vzoriek je potrebné špeciálne spracovanie prípravkov.
Prvým problémom je, že elektróny majú veľmi obmedzenú penetračnú silu, takže je potrebné pripraviť ultratenké rezy s hrúbkou 50 - 100 nm. Na získanie takýchto tenkých rezov sa tkanivo najskôr impregnuje živicou: živica polymerizuje a vytvorí tvrdý plastový blok. Potom sa pomocou ostrého skleneného alebo diamantového noža narežú rezy na špeciálnom mikrotóme.
Existuje ďalší problém: keď elektróny prechádzajú biologickým tkanivom, nezíska sa kontrastný obraz. Aby sa dosiahol kontrast, tenké rezy biologických vzoriek sa impregnujú soľami ťažkých kovov.
Existujú dva hlavné typy elektrónových mikroskopov. V transmisnom (transmisnom) mikroskope zanecháva lúč elektrónov, prechádzajúci cez špeciálne pripravenú vzorku, svoj obraz na obrazovke. Rozlíšenie moderného transmisného elektrónového mikroskopu je takmer 400-krát väčšie ako rozlíšenie svetla. Tieto mikroskopy majú rozlíšenie asi 0,5 nm.
Napriek takémuto vysokému rozlíšeniu majú transmisné elektrónové mikroskopy veľké nevýhody:
musíte pracovať s pevnými materiálmi;
obraz na obrazovke je dvojrozmerný (plochý);
Pri liečbe ťažkými kovmi sú niektoré bunkové štruktúry zničené a modifikované.
Trojrozmerný (objemový) obraz sa získa pomocou skenovacieho elektrónového mikroskopu (EM). Tu lúč neprechádza cez vzorku, ale odráža sa od jej povrchu.
Skúšobná vzorka je fixovaná a vysušená, potom je pokrytá tenkou vrstvou kovu, operácia nazývaná tieňovanie (vzorka je zatienená).
Pri skenovaní EM je zaostrený elektrónový lúč nasmerovaný na vzorku (vzorka je skenovaná). Výsledkom je, že kovový povrch vzorky emituje sekundárne elektróny s nízkou energiou. Sú zaznamenané a prevedené na obraz na televíznej obrazovke. Maximálne rozlíšenie skenovacieho mikroskopu je malé, asi 10 nm, ale obraz je trojrozmerný.
Druhy elektrónovej mikroskopie:
Amplitúdová elektrónová mikroskopia- Metódy amplitúdovej elektrónovej mikroskopie možno použiť na spracovanie obrazov amorfných a iných telies (ktorých veľkosti častíc sú menšie ako vzdialenosť rozlíšená v elektrónovom mikroskope), ktoré rozptyľujú elektróny difúzne. Napríklad v transmisnom elektrónovom mikroskope je kontrast obrazu, t. j. rozdiel v jasoch obrazu susedných oblastí objektu, na prvé priblíženie úmerný rozdielu v hrúbke týchto oblastí.
Fázová elektrónová mikroskopia- Na výpočet kontrastu obrazov kryštalických telies s pravidelnými štruktúrami, ako aj na riešenie inverznej úlohy - výpočet štruktúry objektu z pozorovaného obrazu - sa používajú metódy fázovej elektrónovej mikroskopie. Uvažuje sa o problematike difrakcie elektrónovej vlny na kryštálovej mriežke, ktorej riešenie navyše zohľadňuje nepružné interakcie elektrónov s objektom: rozptyl plazmou, fonónmi atď. V transmisných elektrónových mikroskopoch a skenovacom prenose s vysokým rozlíšením elektrónové mikroskopy, obrazy jednotlivých molekúl alebo atómov ťažkých prvkov. Pomocou metód fázovej elektrónovej mikroskopie je možné z obrázkov rekonštruovať trojrozmernú štruktúru kryštálov a biologických makromolekúl.
Kvantitatívna elektrónová mikroskopia- Metódy kvantitatívnej elektrónovej mikroskopie sú presné meranie rôznych parametrov skúmanej vzorky alebo procesu, napríklad meranie lokálnych elektrických potenciálov, magnetických polí, mikrogeometria povrchového reliéfu atď.
Lorentzova elektrónová mikroskopia- Študijný odbor Lorentzovej elektrónovej mikroskopie, v ktorej sa študujú javy spôsobené Lorentzovou silou, sú vnútorné magnetické a elektrické polia alebo vonkajšie rozptylové polia, napríklad polia magnetických domén v tenkých vrstvách, feroelektrické domény, polia hláv na magnetický záznam informácií a pod.
Polarizačná mikroskopia
Polarizačná mikroskopia je pozorovacia metóda v polarizovanom svetle na mikroskopické skúmanie prípravkov obsahujúcich opticky anizotropné prvky (alebo pozostávajúce výlučne z takýchto prvkov). Patria sem mnohé minerály, zrná v tenkých rezoch zliatin, niektoré živočíšne a rastlinné tkanivá atď. Pozorovanie možno vykonávať v prechádzajúcom aj odrazenom svetle. Svetlo vyžarované iluminátorom prechádza cez polarizátor. Polarizácia, ktorá je mu udelená, sa mení s následným prechodom svetla prípravkom (alebo odrazom od neho). Tieto zmeny sa študujú pomocou analyzátora a rôznych optických kompenzátorov. Analýzou takýchto zmien je možné posúdiť hlavné optické charakteristiky anizotropných mikroobjektov: silu dvojlomu, počet optických osí a ich orientáciu, rotáciu roviny polarizácie a dichroizmus.
Metóda fázového kontrastu
Metóda fázový kontrast a jeho rozmanitosť – tzv. metóda „anoptrálny“ kontrast sú navrhnuté tak, aby získali obrazy priehľadných a bezfarebných objektov, ktoré sú neviditeľné pri pozorovaní pomocou metódy jasného poľa. Patria sem napríklad živé nezafarbené tkanivá zvierat. Podstatou metódy je, že aj pri veľmi malých rozdieloch v indexoch lomu rôznych prvkov prípravku prechádza svetelná vlna cez ne rôzne zmeny vo fáze (nadobúda tzv. fázový reliéf). Tieto fázové zmeny, ktoré nie sú priamo vnímané okom ani fotografickou platňou, sa pomocou špeciálneho optického zariadenia premieňajú na zmeny amplitúdy svetelnej vlny, t. j. na zmeny jasu („amplitúdový reliéf“). už viditeľné okom alebo zaznamenané na fotocitlivej vrstve. Inými slovami, vo výslednom viditeľnom obraze distribúcia jasu (amplitúda) reprodukuje fázový reliéf. Takto získaný obraz sa nazýva fázový kontrast.
Typická prevádzková schéma metódy: v prednom ohnisku kondenzora je inštalovaná apertúrna membrána, ktorej otvor má tvar prstenca. Jeho obraz sa objaví v blízkosti zadného ohniska objektívu a tzv. fázová doska, na ktorej povrchu je prstencový výčnelok alebo prstencová drážka, nazývaná fázový krúžok. Fázová doska nie je vždy umiestnená v ohnisku šošovky - fázový krúžok sa často aplikuje priamo na povrch jednej zo šošoviek objektívu.
V každom prípade lúče z iluminátora, ktoré nie sú v prípravku vychýlené a vytvárajú obraz membrány, musia úplne prejsť fázovým prstencom, čo ich výrazne oslabí (sa stane absorbujúcim) a zmení svoju fázu o l/4 (l je vlnová dĺžka svetla). A lúče, dokonca aj mierne vychýlené (rozptýlené) v prípravku, prechádzajú fázovou doskou, obchádzajú fázový prstenec a nepodliehajú ďalšiemu fázovému posunu.
Ak vezmeme do úvahy fázový posun v prípravnom materiáli, celkový fázový rozdiel medzi vychýlenými a nevychýlenými lúčmi je blízky 0 alebo l/2 a v dôsledku interferencie svetla v obrazovej rovine preparátu sa navzájom výrazne posilňujú alebo oslabujú, čím sa vytvára kontrastný obraz štruktúry prípravku. Vychýlené lúče majú výrazne nižšiu amplitúdu v porovnaní s neodchýlenými lúčmi, preto oslabenie hlavného lúča vo fázovom prstenci, zbližovanie hodnôt amplitúdy k sebe vedie aj k väčšiemu kontrastu obrazu.
Metóda umožňuje rozlíšiť malé konštrukčné prvky, ktoré sú pri metóde svetlého poľa extrémne nízko kontrastné. Transparentné častice, ktoré majú relatívne malú veľkosť, rozptyľujú svetelné lúče pod takými malými uhlami, že tieto lúče prechádzajú spolu s tými, ktoré nie sú vychýlené cez fázový prstenec. Pre takéto častice dochádza k efektu fázového kontrastu iba v blízkosti ich obrysov, kde dochádza k silnému rozptylu.
Infračervená metóda pozorovania
Metóda pozorovania v infračervenom spektre(IR) lúče si tiež vyžadujú premenu okom neviditeľného obrazu na viditeľný pomocou fotografie alebo pomocou elektrónovo-optického konvertora. IR mikroskopia umožňuje študovať vnútornú štruktúru predmetov, ktoré sú vo viditeľnom svetle nepriehľadné, ako sú tmavé sklá, niektoré kryštály a minerály atď.
Metóda ultrafialového pozorovania
Metóda pozorovania v ultrafialovom (UV) žiarení umožňuje zvýšiť maximálne rozlíšenie mikroskopu. Hlavnou výhodou metódy je, že častice mnohých látok, priehľadné vo viditeľnom svetle, silne absorbujú UV žiarenie určitých vlnových dĺžok, a preto sú na UV obrazoch ľahko rozlíšiteľné. Mnohé látky obsiahnuté v rastlinných a živočíšnych bunkách (purínové zásady, pyrimidínové zásady, väčšina vitamínov, aromatické aminokyseliny, niektoré lipidy, tyroxín atď.) majú charakteristické absorpčné spektrá v UV oblasti.
Keďže ultrafialové lúče sú pre ľudské oko neviditeľné, obrazy v UV mikroskopii sa zaznamenávajú buď fotograficky, alebo pomocou elektrónovo-optického konvertora alebo fluorescenčnej obrazovky. Droga je fotografovaná v troch vlnových dĺžkach UV spektra. Každý z výsledných negatívov je osvetlený špecifickou farbou viditeľného svetla (napríklad modrá, zelená a červená) a všetky sú súčasne premietané na jediné plátno. Výsledkom je farebný obraz objektu v konvenčných farbách v závislosti od absorpčnej kapacity liečiva v ultrafialovom svetle.
Mikrofotografia a mikrokino- ide o získavanie obrazov na fotocitlivých vrstvách pomocou mikroskopu. Táto metóda je široko používaná v spojení so všetkými ostatnými metódami mikroskopického vyšetrenia. Pre mikrofotografiu a mikrokino je potrebná určitá reštrukturalizácia optického systému mikroskopu – odlišná od vizuálneho pozorovania zaostrenia okuláru vzhľadom na obraz daný objektívom. Mikrofotografia je nevyhnutná pri dokumentovaní výskumu, pri štúdiu objektov v UV a IR lúčoch neviditeľných pre oči (pozri vyššie), ako aj objektov s nízkou intenzitou luminiscencie. Fotografia na mikrofilm je nenahraditeľná pri štúdiu procesov, ktoré sa v priebehu času rozvíjajú (životne dôležitá aktivita tkanivových buniek a mikroorganizmov, rast kryštálov, výskyt jednoduchých chemických reakcií atď.).
Metóda interferenčného kontrastu
Metóda interferenčného kontrastu (interferenčná mikroskopia) pozostáva z rozdelenia každého lúča pri vstupe do mikroskopu. Jeden z výsledných lúčov smeruje cez pozorovanú časticu, druhý - okolo nej pozdĺž rovnakej alebo ďalšej optickej vetvy mikroskopu. V okulárovej časti mikroskopu sú oba lúče opäť spojené a navzájom sa rušia. Kondenzátor a šošovka sú vybavené dvojlomnými doskami, z ktorých prvá rozdeľuje pôvodný svetelný lúč na dva lúče a druhá ich spája. Jeden z lúčov prechádzajúci objektom je fázovo oneskorený (nadobudne dráhový rozdiel v porovnaní s druhým lúčom). Veľkosť tohto oneskorenia sa meria kompenzátorom. Táto metóda umožňuje pozorovať priehľadné a bezfarebné predmety, ale ich obrazy môžu byť aj viacfarebné (interferenčné farby). Táto metóda je vhodná na štúdium živých tkanív a buniek a v mnohých prípadoch sa na tento účel používa. Metóda interferenčného kontrastu sa často používa v spojení s inými mikroskopickými metódami, najmä s pozorovaním v polarizovanom svetle. Jeho použitie v kombinácii s ultrafialovou mikroskopiou umožňuje napríklad určiť obsah nukleových kyselín v celkovej sušine predmetu.
Výskumná metóda v luminiscenčnom svetle
Metóda štúdie vo svetle luminiscencie spočíva v pozorovaní pod mikroskopom zeleno-oranžovej žiary mikroobjektov, ku ktorej dochádza pri osvetlení modrofialovým svetlom alebo okom neviditeľnými ultrafialovými lúčmi. Do optického obvodu mikroskopu sú zavedené dva svetelné filtre. Jeden z nich je umiestnený pred kondenzátorom. Prepúšťa žiarenie zo zdroja iluminátora len na tých vlnových dĺžkach, ktoré vybudia luminiscenciu buď samotného objektu (vnútorná luminiscencia), alebo špeciálnych farbív zavedených do prípravku a pohltených jeho časticami (sekundárna luminiscencia). Druhý filter, ktorý je inštalovaný za šošovkou, prepúšťa do oka pozorovateľa (alebo do fotocitlivej vrstvy) iba luminiscenčné svetlo. Fluorescenčná mikroskopia využíva osvetlenie preparátov ako zhora (cez šošovku, ktorá v tomto prípade slúži aj ako kondenzor), tak aj zdola, cez bežný kondenzor. Metóda našla široké uplatnenie v mikrobiológii, virológii, histológii, cytológii, v potravinárskom priemysle, vo výskume pôdy, v mikrochemickej analýze a pri detekcii chýb. Táto rôznorodosť aplikácií sa vysvetľuje veľmi vysokou farebnou citlivosťou oka a vysokým kontrastom obrazu samostatne svietiaceho objektu na tmavom, neluminiscenčnom pozadí.
Metóda repliky
Metóda repliky sa používa na štúdium povrchovej geometrickej štruktúry masívnych telies. Z povrchu takéhoto telesa sa odoberie odtlačok vo forme tenkého filmu uhlíka, kolódia, formvaru atď., pričom sa opakuje povrchový reliéf a skúma sa v transmisnom elektrónovom mikroskope. Zvyčajne sa pri kĺzavom (malom k povrchu) uhle nastrieka na repliku vo vákuu vrstva ťažkého kovu, ktorá silne rozptyľuje elektróny, čím zatieňuje výstupky a priehlbiny geometrického reliéfu.
Spôsob zdobenia
Dekoračná metóda skúma nielen geometrickú štruktúru povrchov, ale aj mikropolia spôsobené prítomnosťou dislokácií, akumuláciou bodových defektov, rastovými štádiami kryštalických plôch, doménovou štruktúrou atď. Podľa tejto metódy sa veľmi tenká vrstva dekoračných častíc (Au atómy) sa najskôr nanáša na povrch vzorky , Pt a pod., molekuly polovodičov alebo dielektrík), deponuje sa hlavne v oblastiach, kde sa sústreďujú mikropolia, a potom sa odstráni replika s inklúziami dekoračných častíc.
Na získanie bunkových frakcií sa široko používajú rôzne typy centrifugácie: diferenciálna centrifugácia, zonálna centrifugácia a centrifugácia s rovnovážnym hustotným gradientom. Teoretické a praktické otázky súvisiace s centrifugáciou sú komplexne diskutované v Sykesovom prehľade.
Diferenciálna centrifugácia
V prípade diferenciálnej centrifugácie sa vzorky odstreďujú určitý čas pri danej rýchlosti, po ktorej sa odstráni supernatant. Táto metóda je užitočná na oddeľovanie častíc, ktoré sa značne líšia v rýchlosti sedimentácie. Napríklad centrifugácia počas 5-10 minút pri 3000-5000 dňoch vedie k sedimentácii intaktných bakteriálnych buniek, zatiaľ čo väčšina bunkových fragmentov zostáva v supernatante. Fragmenty bunkovej steny a veľké membránové štruktúry môžu byť peletované centrifugáciou pri 20 000 - 50 000 °C počas 20 minút, zatiaľ čo malé membránové vezikuly a ribozómy vyžadujú na peletovanie centrifugáciu pri 200 000 °C počas 1 hodiny.
Zónová centrifugácia
Zonálna centrifugácia je efektívna metóda na separáciu štruktúr, ktoré majú podobné vztlakové hustoty, ale líšia sa tvarom a hmotnosťou častíc. Príklady zahŕňajú separáciu ribozomálnych podjednotiek, rôznych tried polyzómov a molekúl DNA rôznych tvarov. Odstreďovanie sa vykonáva buď v korčekových rotoroch alebo v špeciálne navrhnutých zónových rotoroch; Aby sa zabránilo konvekcii počas odstreďovania, vytvára sa slabý gradient (zvyčajne sacharóza) v kadičkových kadičkách rotora alebo v komore zonálneho rotora. Vzorka sa aplikuje vo forme zóny alebo úzkeho prúžku na samom vrchole gradientového stĺpca. Pre subcelulárne častice sa typicky používa sacharózový gradient 15 až 40 % (w/v).
Laueho metóda
používa sa na monokryštály. Vzorka je ožarovaná lúčom so spojitým spektrom, vzájomná orientácia lúča a kryštálu sa nemení. Uhlové rozloženie difraktovaného žiarenia má podobu jednotlivých difrakčných škvŕn (Lauegram).
Debye-Scherrerova metóda
Používa sa na štúdium polykryštálov a ich zmesí. Náhodná orientácia kryštálov vo vzorke vzhľadom na dopadajúci monochromatický lúč premení difraktované lúče na rodinu koaxiálnych kužeľov s dopadajúcim lúčom na osi. Ich obraz na fotografickom filme (debyegram) má formu sústredných prstencov, ktorých umiestnenie a intenzita nám umožňuje posúdiť zloženie skúmanej látky.
Metóda kultivácie buniek
Niektoré tkanivá možno rozdeliť na jednotlivé bunky, takže bunky ostanú živé a často sa dokážu rozmnožovať. Táto skutočnosť definitívne potvrdzuje myšlienku bunky ako živej jednotky. Špongia, primitívny mnohobunkový organizmus, sa dá rozdeliť na bunky pretretím cez sito. Po určitom čase sa tieto bunky znova spoja a vytvoria špongiu. Živočíšne embryonálne tkanivá môžu byť disociované pomocou enzýmov alebo iných prostriedkov, ktoré oslabujú väzby medzi bunkami.
Americký embryológ R. Garrison (1879-1959) ako prvý dokázal, že embryonálne a dokonca aj niektoré zrelé bunky môžu rásť a množiť sa mimo tela vo vhodnom prostredí. Túto techniku, nazývanú kultivácia buniek, zdokonalil francúzsky biológ A. Carrel (1873-1959). Rastlinné bunky možno pestovať aj v kultúre, ale v porovnaní so živočíšnymi bunkami tvoria väčšie zhluky a sú k sebe pevnejšie pripojené, takže pri raste kultúry sa tvoria skôr tkanivá ako jednotlivé bunky. V bunkovej kultúre môže byť z jednej bunky vypestovaná celá dospelá rastlina, ako napríklad mrkva.
Metóda mikrofigury
Pomocou mikromanipulátora je možné jednotlivé časti bunky odoberať, pridávať alebo nejakým spôsobom upravovať. Veľkú amébovú bunku možno rozdeliť na tri hlavné zložky – bunkovú membránu, cytoplazmu a jadro a následne tieto zložky možno znovu poskladať a vytvoriť živú bunku. Týmto spôsobom možno získať umelé bunky pozostávajúce zo zložiek rôznych typov améb.
Ak vezmeme do úvahy, že sa zdá, že je možné syntetizovať niektoré bunkové zložky umelo, potom experimenty v zostavovaní umelých buniek môžu byť prvým krokom k vytvoreniu nových foriem života v laboratóriu. Keďže každý organizmus sa vyvíja z jednej bunky, spôsob výroby umelých buniek v zásade umožňuje konštrukciu organizmov daného typu, ak sa súčasne používajú zložky mierne odlišné od tých, ktoré sa nachádzajú v existujúcich bunkách. V skutočnosti však nie je potrebná úplná syntéza všetkých bunkových zložiek. Štruktúra väčšiny, ak nie všetkých zložiek bunky je určená nukleovými kyselinami. Problém vytvárania nových organizmov teda spočíva v syntéze nových typov nukleových kyselín a ich náhrade prirodzených nukleových kyselín v určitých bunkách.
Metóda bunkovej fúzie
Iný typ umelých buniek možno získať fúziou buniek rovnakého alebo odlišného druhu. Na dosiahnutie fúzie sú bunky vystavené vírusovým enzýmom; v tomto prípade sú vonkajšie povrchy dvoch buniek zlepené a membrána medzi nimi je zničená a vzniká bunka, v ktorej sú dve sady chromozómov uzavreté v jednom jadre. Je možné spájať bunky rôznych typov alebo v rôznych štádiách delenia. Pomocou tejto metódy bolo možné získať hybridné bunky myši a sliepky, človeka a myši a človeka a ropuchy. Takéto bunky sú hybridné iba spočiatku a po početných deleniach buniek strácajú väčšinu chromozómov jedného alebo druhého typu. Konečným produktom sa stáva napríklad v podstate myšacia bunka bez alebo len v stopovom množstve prítomných ľudských génov. Zvlášť zaujímavá je fúzia normálnych a malígnych buniek. V niektorých prípadoch sa hybridy stanú zhubnými, v iných nie, t.j. obe vlastnosti sa môžu prejaviť ako dominantné aj recesívne. Tento výsledok nie je neočakávaný, pretože malignita môže byť spôsobená rôznymi faktormi a má zložitý mechanizmus.
svetlo bunkovej mikroskopie
Príloha 1
Obrázok 2. Kryotóm Obrázok 3. Mikroskop s fázovým kontrastom
Obrázok 4. Interferenčný mikroskop
Uverejnené na Allbest.ru
...Podobné dokumenty
Štúdium štruktúry a princípov fungovania svetelných a elektrónových mikroskopov. Zváženie techník tmavého a svetlého poľa, mikroskopie s fázovým kontrastom, interferencie a polarizácie. Štúdia vitálnych fixných buniek. Základy elektrónovej mikroskopie.
prednáška, pridané 16.05.2014
Skenovací tunelový mikroskop, aplikácia. Princíp činnosti mikroskopu atómových síl. Štúdium biologických objektov - makromolekúl (vrátane molekúl DNA), vírusov a iných biologických štruktúr pomocou mikroskopie atómových síl.
kurzová práca, pridané 28.04.2014
Pojem elektrónová mikroskopia ako súbor metód na štúdium mikroštruktúr telies a ich lokálneho zloženia pomocou elektrónových mikroskopov. Obsah televízneho princípu skenovania tenkého zväzku elektrónov alebo iónov nad povrchom vzorky.
prezentácia, pridané 22.08.2015
Meranie veľkosti malých predmetov. Metóda fázového kontrastu. Pojem elektrónovej optiky. Vytvorenie elektrónového mikroskopu. Experimenty s elektrónovou difrakciou. Výskum povrchovej geometrickej štruktúry buniek, vírusov a iných mikroobjektov.
prezentácia, pridané 05.12.2017
Metóda výskumu elektrónového mikroskopu. Fyzikálne základy rastrovacej elektrónovej mikroskopie. Schéma rastrovacieho elektrónového mikroskopu, účel jeho komponentov a ich fungovanie. Príprava objektov na výskum a špeciálne požiadavky na ne.
kurzová práca, pridané 04.05.2011
Rozsah optického spektra. Teoretické základy optických NDT metód. Ľahké vibrácie. Klasifikácia optických NDT metód. Diskrétne emisné spektrum plynov a kvapalín. Spojité spektrum vlastného žiarenia pevných látok s rôznymi teplotami.
abstrakt, pridaný 15.01.2009
Všeobecná charakteristika metód používaných na meranie parametrov kapilár trysiek: holografická interferometria, Fourierova optika, mikroskopická. Porovnávacia analýza uvažovaných metód, určenie ich hlavných výhod a nevýhod.
test, pridané 20.05.2013
Vytvorenie mikroskopu atómovej sily, princíp činnosti, výhody a nevýhody. Metódy mikroskopie atómových síl. Technické možnosti mikroskopu atómových síl. Aplikácia mikroskopie atómovej sily na opis deformácií polymérnych filmov.
kurzová práca, pridané 14.11.2012
História mikroskopu – prístroj na získavanie zväčšených obrazov predmetov voľným okom neviditeľných. Metódy svetelnej mikroskopie. Princíp činnosti a štruktúra metalografického mikroskopu. Metódy mikroskopického skúmania kovov.
abstrakt, pridaný 6.10.2009
Základy rastrovacej elektrónovej mikroskopie. Metodologické znaky elektrónového mikroskopického skúmania tavenín kovov. Vlastnosti mikroskopov určených na štúdium štruktúry povrchových vrstiev kovových tavenín.
E. Mikroskopia v tmavom poli.
18. Mikroskop pozostáva z optickej a mechanickej časti. Čo sú optické časti?
A. Rúrka, okulár, kondenzor
B. Revolver, makro- a mikroskrutka, zrkadlo
C. Revolver, okulár
D. Okulár, kondenzor, objektív
E. Tubus, okulár, revolver
19. Pri použití ultrafialových lúčov ako zdroja svetla sa zvyšuje rozlišovacia schopnosť mikroskopu. Ktoré mikroskopické zariadenia používajú tento zdroj svetla?
A. Tmavé pole a luminiscenčné
B. Luminiscenčné, ultrafialové
S. Svetlé a elektronické
D.Fázový kontrast, ultrafialový
E. Polarizačné, ultrafialové
20. Mikroskop pozostáva z mechanických a optických častí. Ktoré časti mikroskopu majú clonu?
A. Okulár a objektív
B. Okulár a kondenzor
C. Tubus a okulár
D. Objektív a kondenzor
E. Tubus, šošovka, okulár
21. V experimente boli použité živé objekty, v ktorých je potrebné pomocou životne dôležitého pozorovania určiť množstvo chemických zložiek. Aká mikroskopická vyšetrovacia metóda sa použije?
A. Fázová kontrastná mikroskopia
B. Elektrónová mikroskopia
C. Fluorescenčná mikroskopia
E Mikroskopia v tmavom poli.
22. Na histologické vyšetrenie buniek sa použili fosfory. Aký typ mikroskopie bol použitý v tomto prípade?
A. Svetelná mikroskopia
B. Elektrónová mikroskopia
C. Fluorescenčná mikroskopia
D. Polarizačná mikroskopia
E. Mikroskopia v tmavom poli.
23. Úlohou výskumníka je získať priestorové pochopenie štruktúr skúmaného objektu. S akým mikroskopickým prístrojom bude špecialista pracovať?
A. Ultrafialová mikroskopia,
B. Fázová kontrastná mikroskopia,
C. Transmisná elektrónová mikroskopia,
D. Rastrovacia elektrónová mikroskopia,
E. Polarizačná mikroskopia
24. Ako zdroj svetla sa používajú ortuťovo-kremenné výbojky. Aké je rozlíšenie mikroskopu s týmto svetelným zdrojom?
25. Rozlíšenie mikroskopu závisí od vlnovej dĺžky svetelného zdroja. Aká je rozlišovacia schopnosť svetelného mikroskopu?
26. Pred začatím vyšetrenia histologického preparátu je potrebné rovnomerne osvetliť zorné pole. Aké časti mikroskopu sa na to používajú?
A. Mikro- a makrovit
B. Kondenzátor a zrkadlo
C. Trubica a držiak trubice
D. Tubus a okulár
27. Výskumník mal za úlohu študovať ultramikroskopickú štruktúru plazmalemy erytrocytov. Aký mikroskopický prístroj sa použije?
A. Svetová
B. Fázový kontrast
C. Elektronické
D. Polarizácia
E. Ultrafialové
28. Pri štúdiu tkaniva kostrového svalstva je potrebné určiť izo- a anizotropné štruktúry tkaniva. Aký typ mikroskopie sa použije?
A. Svetová
B. Fázový kontrast
C. Elektronické
D. Polarizácia
E. Ultramikroskopické
29. Rozlíšenie fluorescenčného mikroskopu závisí od vlnovej dĺžky svetelného zdroja. Čomu sa to rovná?
A. 0,1 um C. 0,4 um
B. 0,2 um D. 0,1 nm
30. V klinickom laboratóriu sa mikroskopické vyšetrenia používajú na štúdium kompletného krvného obrazu. Aký mikroskop je na to potrebný?
A. Svetovoy,
B. Fázový kontrast,
S. Electronic,
D. Polarizácia,
E. Ultrafialové.
31. Živý objekt s prirodzenou luminiscenciou je prezentovaný na výskum. Aký typ mikroskopie by sa mal použiť na túto štúdiu?
A. Svetová
B. Fázový kontrast
C. Elektronické
D. Polarizácia
E. Ultrafialové
32. Ako výsledok biopsie sa získal materiál nádorových buniek. Je potrebné študovať ich ultramikroskopickú štruktúru. Aký typ mikroskopie sa používa v tejto štúdii?
A. Svetová
B. Fázový kontrast
C. Elektronické
D. Polarizácia
E. Ultrafialové
TÉMA 2: HISTOLOGICKÁ TECHNIKA
Základné princípy prípravy preparátov pre svetelnú a elektrónovú mikroskopiu, odber materiálu (biopsia, ihlová biopsia, pitva). Fixácia, dehydratácia, zhutňovanie predmetov, príprava rezov na mikrotóme a ultramikrotóme. Druhy mikropreparátov - rez, náter, odtlačok, film, tenký rez. Farbiace a kontrastné prípravky. Koncept histologických farbív.
Mikroskopická technika.
Hlavné fázy cytologickej a histologickej analýzy:
Výber výskumného objektu
Príprava na vyšetrenie pod mikroskopom
Aplikácia mikroskopických metód
Kvalitatívna a kvantitatívna analýza získaných obrázkov
Metódy používané v histologickej technológii:
1. Životnosť.
2. Posmrtný.
I INTERVITUÁLNE METÓDY
Účelom intravitálneho výskumu je získať informácie o živote bunky: pohyb, delenie, rast, diferenciácia, bunková interakcia, dĺžka života, deštrukcia, reaktívne zmeny pod vplyvom rôznych faktorov.
Štúdium živých buniek a tkanív je možné mimo tela (in vitro) alebo vo vnútri tela (in vivo).
A. Štúdium živých buniek a tkanív v kultúre (in vitro) –
Kultivačná metóda
Rozlišujú sa: a) suspenzné kultúry (bunky suspendované v živnom médiu), b) tkanivové, c) orgánové, d) jednovrstvové.
Metóda kultivácie tkaniva mimo tela je najbežnejšia. Tkanivo je možné kultivovať v špeciálnych priehľadných hermeticky uzavretých komorách. Za sterilných podmienok sa do komory umiestni kvapka živného média. Najlepším živným médiom je krvná plazma, do ktorej sa pridáva embryonálny extrakt (extrakt z tkanív embrya obsahujúci veľké množstvo látok stimulujúcich rast). Tam je tiež umiestnený kúsok orgánu alebo tkaniva (nie viac ako 1 mm3), ktorý je potrebné kultivovať.
Kultivované tkanivo by sa malo udržiavať pri telesnej teplote organizmu, ktorého tkanivo bolo odobraté na výskum. Keďže živné médium sa rýchlo stáva nepoužiteľné (hromadia sa v ňom produkty rozkladu uvoľnené kultivovaným tkanivom), je potrebné ho každých 3-5 dní meniť.
Použitie kultivačnej metódy umožnilo identifikovať množstvo vzorcov diferenciácie, malígnej degenerácie buniek, interakcií buniek medzi sebou, ako aj s vírusmi a mikróbmi. Kultivácia embryonálnych tkanív umožnila študovať vývoj kostí, chrupaviek, kože atď.
Kultivačná metóda má osobitný význam pre uskutočňovanie experimentálnych pozorovaní na ľudských bunkách a tkanivách, najmä na určenie pohlavia, malígnej degenerácie, dedičných chorôb atď.
Nevýhody metódy:
1. Hlavnou nevýhodou tejto metódy je, že tkanivo alebo orgán sa vyšetruje izolovane od tela. Bez toho, aby zažil neurohumorálny vplyv tela, stráca svoju prirodzenú diferenciáciu.
2. Potreba častých transplantácií (pri dlhodobej kultivácii).
3. Identický index lomu tkanív.
Súvisiace informácie.
Polarizačná mikroskopia- jedna z vysoko efektívnych metód morfologického výskumu, ktorá má široké možnosti identifikácie biologických štruktúr, čo v kombinácii s dostupnosťou a relatívnou jednoduchosťou určuje jej vysokú hodnotu. Metóda umožňuje študovať nielen histologickú štruktúru liečiva, ale aj niektoré jeho histochemické parametre. V 40-tych a 50-tych rokoch XX storočia. polarizačná mikroskopia bola považovaná za ultraštrukturálnu metódu, pretože umožňovala vidieť ultraštrukturálne schopnosti tkanív.
Polarizačná mikroskopia je určená na štúdium vlastností histologických štruktúr, ktoré majú schopnosť dvojlomu (anizotropie) – štiepenia svetelného lúča pri prechode anizotropným prostredím. Svetelná vlna v anizotropnom prostredí sa rozpadá na dve vlny so vzájomne kolmými rovinami kmitania elektromagnetických vĺn. Tieto roviny sa nazývajú roviny polarizácie. Polarizované svetlo sa líši od bežného (nepolarizovaného) svetla tým, že v druhom menovanom svetelné vlny kmitajú v rôznych rovinách, zatiaľ čo v polarizovanom svetle sa vyskytujú len v určitej rovine.
Na vytvorenie polarizačného efektu používa polarizačný mikroskop dva polaroidy. Prvý, ktorý sa nazýva polarizátor, je umiestnený medzi iluminátorom mikroskopu a histologickou vzorkou. Druhý polaroid, ktorý sa nachádza medzi histologickou vzorkou a okom výskumníka, je analyzátor. Polarizátor aj analyzátor sú opticky úplne rovnaké polarizačné filtre, takže je možné ich zamieňať (ak to konštrukcia mikroskopu umožňuje). Predtým sa na polarizačnú mikroskopiu používali hranoly Nicolas, Arens alebo Thomson vyrobené z islandského nosníka. Tieto hranoly mali obmedzený uhol lomu svetla. V súčasnosti sa namiesto nich používajú ploché polarizačné filtre, produkujúce širokopoľné polarizované svetlo.
Pri vytváraní polarizovaného svetla zohráva rozhodujúcu úlohu relatívna poloha polarizátora a analyzátora vzhľadom na optickú os mikroskopu. Ak sú orientované tak, že obe prepúšťajú polarizované svetlo v rovnakej rovine, t.j. keď sa ich roviny polarizácie zhodujú, oba polarizačné filtre sú schopné prenášať polarizované svetlo; zorné pole mikroskopu je svetlé (obr. 1a).
Ryža. 1 Brightfieldová vzorka ľudských pľúc, OlympusCX41, 10x šošovka
Ak sú polarizačné roviny polarizačných filtrov navzájom kolmé (to sa dosiahne otočením analyzátora o 90° okolo optickej osi mikroskopu), potom polarizované svetlo neprejde a výskumník vidí tmavé zorné pole (obr. 2).
Keď sa polarizátor pri otáčaní otočí o 360°, zorné pole sa dvakrát úplne stmaví a dvakrát sa úplne rozjasní. V minulosti sa používali kompenzačné Bernauerove filtre, ktoré vytvárajú červenkastý odtieň tmavého zorného poľa ( U-TP530 ). Pri použití čiernych zrkadlových filtrov sa stmavené zorné pole nezdá úplne tmavé, ale skôr slabo osvetlené.
Obr. 2 Vzorka ľudských pľúc v polarizovanom svetle, 10x objektív
V prípadoch, keď sa pri skríženej polohe polarizačných filtrov (t.j. pri ortoskopii) v dráhe polarizovaného svetla stretnú anizotropné látky obsiahnuté v histologickej vzorke, tieto látky rozdelia polarizované svetlo na dva lúče so vzájomne kolmými rovinami kmitania svetla. vlny. Svetelné lúče s rovinou vibrácií zhodujúcou sa s rovinou polarizácie prechádzajú cez analyzátor a tie s rovinou kolmou sú odrezané, v dôsledku čoho je intenzita svetelného toku vstupujúceho do oka výskumníka a do kamery len polovičná. intenzitu pôvodného svetelného lúča. V dôsledku opísaných procesov sú anizotropné látky nachádzajúce sa medzi dvoma skríženými polarizátormi viditeľné na tmavom pozadí vo forme svetlých svietiacich predmetov. Zároveň zostávajú tmavé izotropné štruktúry, ktoré nemajú schopnosť dvojlomu.
To tiež ovplyvňuje výber kamery pre polarizačnú mikroskopiu. Keďže úlohou je zachytiť malé jasné signály na tmavom pozadí, zvyčajne kamera pre mikroskopiu vo svetlom poli nemusí stačiť kvôli nízkej citlivosti kamery a veľkému množstvu šumu, ktorý vzniká pri nahrávaní. Pre polarizačnú mikroskopiu Vyžaduje sa mikroskopická kamera s vysokou citlivosťou a presnou reprodukciou farieb. Je vhodnejšie použiť kamery založené na matriciach CCD (, VZ-CC50S), avšak v súčasnej fáze môžete použiť aj lacné verzie kamier založených na matriciach CMOS radu Sony IMX ().
Biologické tkanivá obsahujú dostatočné množstvo anizotropných štruktúr: prvky kontraktilného aparátu svalov, amyloid, kyselina močová, kolagénové formácie, niektoré lipidy, množstvo kryštálov atď.
Svetelné lúče rozdelené v anizotropnom objekte a prechádzajúce cez analyzátor sa vyznačujú nerovnakými rýchlosťami šírenia vĺn. V závislosti od veľkosti tohto rozdielu (nazýva sa aj hodnota oneskorenia svetelného lúča) a v dôsledku rozdielov v absorpcii svetla v analyzátore môže byť žiara anizotropných predmetov biela alebo farebná. V druhom prípade hovoríme o fenoméne dichroizmu ( dvojitá absorpcia ja). Pri štúdiu v polarizovanom poli sú farebné efekty produkované napríklad mnohými kryštálmi.
Proces dvojlomu môže byť posilnený použitím určitých farbív, ktorých molekuly majú schopnosť orientovať sa na anizotropné štruktúry. Histochemické reakcie, ktorých výsledkom je anizotropný efekt, sa nazývajú topooptické reakcie (G. Romhanyi). Existujú dva typy takýchto reakcií - aditívne a inverzné. Pri aditívnych reakciách sa zvyšuje oneskorenie svetelného lúča, čo sa nazýva pozitívna anizotropia, pri inverzných reakciách sa znižuje - negatívna anizotropia.
HARDVÉR A VYBAVENIE
Polarizačná mikroskopia sa vykonáva pomocou špeciálnych polarizačných mikroskopov. Ako príklad môžeme uviesť importované mikroskopy. Väčšina moderných optických mikroskopov je vybavená príslušenstvom pre polarizačnú mikroskopiu.
Na polarizačnú mikroskopiu možno použiť akýkoľvek laboratórny alebo výskumný svetelný mikroskop. Stačí mať dva polarizačné filtre, z ktorých jeden, ktorý pôsobí ako polarizátor, je umiestnený medzi zdrojom svetla a vzorkou a druhý, ktorý hrá úlohu analyzátora, je umiestnený medzi vzorkou a okom výskumníka. Polarizátor môže byť zabudovaný do kondenzátora alebo umiestnený pod ním nad clonou poľa a analyzátor môže byť umiestnený v štrbine v revolveri alebo v medziľahlej vložke.
Na obr. Obrázok 3 zobrazuje schematický diagram polarizačného mikroskopu. Okrem súčastí spoločných pre všetky svetelné mikroskopy má polarizačný mikroskop dva polarizačné filtre (polarizačný, zvyčajne umiestnený pod kondenzorom a analyzátor umiestnený v okulári), ako aj kompenzátor. Analyzátor sa musí otáčať a na určenie stupňa otáčania je potrebná vhodná stupnica.
Polarizačný mikroskop využíva zdroj osvetlenia, ktorý poskytuje vysokú hustotu svetelného lúča. Ako taký zdroj sa odporúča použiť 100 W lampu s napätím 12 V. Pre niektoré typy výskumu je potrebné monochromatické svetlo. Na tento účel sa používa kovový interferenčný filter, ktorý je najlepšie umiestniť nad zrkadlo. Svetlo rozptyľujúce matné sklo je umiestnené pred polarizátorom, t.j. medzi ním a zdrojom svetla, ale v žiadnom prípade nie za polarizátorom, pretože to naruší funkciu polarizačného filtra.
V minulosti sa na polarizačnú mikroskopiu používali achromatické objektívy bez vnútorného napätia, tie sú však v súčasnosti zriedkavé. Dnes sa v polarizačných mikroskopoch používajú iba planárne achromatické objektívy, ktoré nemajú vnútorné napätie. Apochromatické šošovky je možné použiť len v prípadoch, keď sa pri mikrofotografii vyžaduje normálne podanie farieb.
Polarizačné mikroskopy sú vybavené otočným stolíkom, ktorého polohu voči optickej osi je možné meniť. Uhol natočenia stola sa meria pomocou stupňovej stupnice vyznačenej po jeho obvode. Jedným z predpokladov efektívneho využitia polarizačnej mikroskopie je starostlivé vyrovnanie otočného stolíka pomocou centrovacích skrutiek.
Dôležitým prvkom polarizačného mikroskopu je kompenzátor umiestnený medzi objektívom a analyzátorom, zvyčajne v tubuse mikroskopu. Kompenzátor je doska vyrobená zo špeciálnych druhov sadry, kremeňa alebo sľudy. Umožňuje zmerať rozdiel v dráhe delených svetelných lúčov vyjadrený v nanometroch. Fungovanie kompenzátora je zabezpečené jeho schopnosťou meniť rozdiel v dráhe svetelných lúčov, znižovať ho na nulu alebo zvyšovať na maximum. To sa dosiahne otáčaním kompenzátora okolo optickej osi.
MIKROSKOPICKÁ TECHNIKA V POLARIZOVANOM SVETLE
Je vhodnejšie vykonávať polarizačnú mikroskopiu v zatemnenej miestnosti, pretože intenzita svetelného toku vstupujúceho do oka výskumníka je znížená 2-krát v porovnaní s pôvodnou. Po zapnutí iluminátora mikroskopu najskôr dosiahnite čo najjasnejšie osvetlenie zorného poľa otáčaním polarizátora alebo analyzátora. Táto poloha polarizačných filtrov zodpovedá zhode ich rovín polarizácie. Droga je umiestnená na javisku a skúmaná najskôr vo svetlom poli. Potom otáčaním polarizátora (alebo analyzátora) sa zorné pole čo najviac stmaví; táto poloha filtra zodpovedá kolmému usporiadaniu rovín polarizácie. Na odhalenie efektu anizotropie je potrebné spojiť rovinu polarizácie anizotropného objektu s rovinou polarizovaného svetla. Empiricky sa to dosahuje otáčaním stolíka okolo optickej osi. Ak sa na polarizačnú mikroskopiu použije svetelný mikroskop, ktorý nie je vybavený otočným stolíkom, potom sa musí histologická vzorka otáčať manuálne. To je prijateľné, ale v tomto prípade nie je možné vykonať určité typy polarizačnej mikroskopie, ktoré si vyžadujú kvantitatívne hodnotenie (určenie znaku dvojlomu, veľkosti rozdielu v dráhe svetelných lúčov).
Ak sú anizotropné objekty v testovacej vzorke usporiadané (napríklad anizotropné disky priečne pruhovaných svalových vlákien), je vhodné ich študovať v pevnej polohe stolíka, v ktorej tieto objekty poskytujú maximálnu luminiscenciu na tmavom pozadí. . Ak sú anizotropné štruktúry v prípravku chaoticky umiestnené (napríklad kryštály), potom pri ich štúdiu musíte neustále otáčať pódium, aby ste dosiahli žiaru jednej alebo druhej skupiny predmetov.
Na vykonanie hlbšej analýzy a hodnotenia topooptických reakcií je potrebné poznať metodiku stanovenia relatívneho znamienka dvojlomu, veľkosti rozdielu v dráhe lúčov a indexu (koeficientu) lom.
Znak dvojlomu charakterizuje stupeň a smer posunu dráhy svetelných lúčov prechádzajúcich analyzátorom. Tento posun je spôsobený topooptickými farbivami a ak smeruje k zníženiu rozdielu v dráhe lúčov, hovorí o negatívnom znaku dvojlomu ( negatívna anizotropia), ak to pomáha zväčšiť rozdiel v dráhe lúčov, potom sa uvádza pozitívny znak dvojlomu ( pozitívna anizotropia). Ak zmizne rozdiel v dráhe lúčov, efekt anizotropie sa vyrovná.
Znak dvojlomu sa určuje pomocou kompenzátora. Postup pri jeho použití je nasledovný. Sledovaný objekt sa umiestni do polohy, v ktorej sa dosiahne maximálna luminiscencia anizotropných štruktúr v tmavom zornom poli. RI kompenzačná doska sa otáča okolo optickej osi pod uhlom +45° vzhľadom k rovine polarizácie analyzátora. Objekt v závislosti od rozdielu v dráhe svetelných lúčov, ktorý sa môže pohybovať od 20 do 200 nm, získava buď modrú alebo žltú farbu. V prvom prípade je znak dvojlomu pozitívny, v druhom - negatívny. Treba mať na pamäti, že v prípade, že je kompenzátor umiestnený pod uhlom +45°, má celkové pozadie tmavého zorného poľa červený odtieň.
Možno použiť aj kompenzátor λ/4 (U-TP137). Postup pri jeho použití je rovnaký, len zorné pole má skôr sivý než červený odtieň a objekt žiari s pozitívnym znakom lomu a je stmavený s negatívnym znakom.
Kvantitatívne stanovenie rozdielu v dráhe svetelných lúčov, vyjadrené v nanometroch, sa uskutočňuje pomocou kompenzátora Braque Köhler. Ak to chcete urobiť, použite vzorec:
Γ=Γλ×sinφ
kde λ je konštanta vyznačená na kompenzátore výrobcom, φ je uhol natočenia kompenzátora voči rovine polarizácie analyzátora.
Index lomu anizotropného objektu sa určuje jeho porovnaním (pod mikroskopom) s testovaným objektom umiestneným vedľa neho. Ako skúšobné objekty sa používajú štandardné kvapaliny so známym indexom lomu. Predmet a vzorka sú umiestnené vedľa seba na javisku. Keď sa ich indexy lomu nezhodujú, medzi objektom a vzorkou je viditeľná svetlá čiara nazývaná Beckova čiara. Zdvihnutie tubusu mikroskopu vzhľadom na zaostrenú polohu spôsobí posun Beckovej línie smerom k médiu, čo dáva výraznejší efekt lomu. Keď sa indexy lomu objektu a vzorky zhodujú, Beckova čiara zmizne. Index lomu sa zvyčajne určuje v monochromatickom svetle pre sodíkovú čiaru spektra (pri vlnovej dĺžke 589 nm a teplote 20 ° C). Lom by sa mal určiť pre dve navzájom kolmé roviny polarizácie. Na tento účel sa analyzátor vyberie a lom objektu sa zaznamená v jeho dvoch vzájomne kolmých polohách. Rozdiel medzi oboma indexmi lomu (ng - nk) charakterizuje silu lomu.
VLASTNOSTI SPRACOVANIA MATERIÁLU A PRÍPRAVY PRÍPRAVKOV
Fixačný materiál pre polarizačnú mikroskopiu v kyslom formalíne je nežiaduci, pretože formalínový pigment vytvorený interakciou tkanivového hemoglobínu s kyslým formaldehydom má anizotropné vlastnosti a sťažuje štúdium preparátov v polarizovanom svetle. G. Scheuner a J. Hutschenreiter (1972) odporúčajú na tento účel použiť 10 % neutrálny formalín, Bakerov kalcium-formolový roztok a Carnoyovu kvapalinu.
Doba fixácie v 10% neutrálnom formalíne je 24 - 72 hodín pri 4 °C, v Bakerovom kalcium-formolovom roztoku - 16 - 24 hodín pri 4 °C. Fixácia v kalcium-formole je obzvlášť výhodná pri štúdiu lipid-proteínových zlúčenín. Carnoyova tekutina rýchlo saturuje látky. Diely s hrúbkou 1 - 2 mm je možné profilovať už po 1 hodine pri teplote 4 °C. Fixácia v Carnoyovej tekutine nie je vhodná na lipidové štúdie. Okrem toho sa používa Zenkerova kvapalina, najmä ak je impregnovaná soľami zlata a striebra. Po ošetrení zmesou Zenkerovej tekutiny a kyseliny octovej získajú červené krvinky schopnosť dvojlomu.
Pri skúmaní hustých tkanív (kosti, zuby) v polarizačnom mikroskope je okrem kyslého odvápnenia potrebné ďalšie spracovanie na odstránenie kolagénových vlákien. Na tento účel sa rezy takýchto tkanív varia niekoľko minút v zmesi glycerínu a hydroxidu draselného (10 ml glycerínu a 2 zrnká hydroxidu draselného), kým úplne nezbelejú, potom sa alkália opatrne scedí, rez sa premyje vodou a prenesené pinzetou na stolík mikroskopu.
Pre polarizačnú mikroskopiu sa používajú parafínové, zmrazené a kryostatické rezy. Nezafarbené zmrazené rezy na vyšetrenie pod polarizovaným svetlom sa vložia do glycerolu. Nefixované rezy kryostatu sú vhodné na polarizačnú mikroskopickú analýzu ihneď po príprave. Vzhľadom na ich vysokú citlivosť na škodlivé účinky rôznych environmentálnych faktorov sa tieto rezy stále odporúčajú fixovať v 10% neutrálnom formaldehydovom alebo vápenato-formolovom roztoku.
Výsledky polarizačnej mikroskopie sú ovplyvnené hrúbkou histologických rezov. Pri štúdiu hrubých rezov sa vytvárajú podmienky pre superpozíciu rôznych anizotropných štruktúr na seba. Okrem toho sa pri rôznych hrúbkach rezov môžu meniť anizotropné vlastnosti skúmaných štruktúr, preto je veľmi dôležité, najmä pri porovnávacích štúdiách, zabezpečiť konštantnú hrúbku rezu. Odporúčaná maximálna hrúbka rezu by nemala presiahnuť 10 µm.
Ďalšou povinnou podmienkou je starostlivé odparafínovanie rezov, pretože neodstránené zvyšky parafínu poskytujú výrazný anizotropný účinok, čo komplikuje štúdiu. Parafín zostáva obzvlášť dlho na červených krvinkách a bunkových jadrách. Na úplné odstránenie parafínu z rezov sa odporúča vykonať nasledujúce spracovanie.
- xylén 30 min
- Alkohol 100% 5 min
- Zmes metanolu a chloroformu (1:1) pri 50 °C počas 24 hodín
- Alkohol 100% 5 min
- Alkohol 70% 10 min Voda
Malo by sa tiež pamätať na to, že rezy, ktoré sa podrobia polarizačnej mikroskopii, by nemali prísť do kontaktu s fenolmi (napríklad by sa nemali čistiť v karbolickom xyléne).
Podrobnejšie informácie o polarizačnej mikroskopii a použití kompenzátorov možno získať z odkazu (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Ak máte akékoľvek otázky týkajúce sa polarizačnej mikroskopie, kontaktujte Školu mikroskopu.
Polarizačné mikroskopy sú zo všetkých druhov prístrojov na mikroskopovanie technicky najzložitejšie. Takáto pozornosť pri konštrukcii prístroja z hľadiska vyrobiteľnosti je spôsobená potrebou získať obrazy najvyššej kvality, ktoré sú priamo ovplyvnené konštrukciou optickej a svetelnej časti mikroskopu. Hlavnou oblasťou použitia polarizačných prístrojov pre mikroskopiu je štúdium minerálov, kryštálov, trosiek, anizotropných predmetov, textílií a žiaruvzdorných výrobkov, ako aj iných materiálov, ktoré sa vyznačujú dvojlomom. Posledný uvedený princíp sa používa na vytváranie obrazov v mikroskopických zariadeniach, v ktorých je skúmaná vzorka ožarovaná polarizačnými lúčmi. V tomto prípade sa anizotropné vlastnosti vzoriek prejavia po zmene smeru lúča. Na tieto účely konštrukcia polarizačných mikroskopov zahŕňa filtre poľa, ktoré sa otáčajú v rôznych rovinách voči sebe navzájom: analyzátor sa otáča o 180 stupňov a polarizátor sa otáča o 360. Hlavnou vlastnosťou zariadení na mikroskopovanie v polarizovanom svetle je schopnosť viesť ortoskopické a konoskopické štúdie, ktoré nie sú dostupné pri väčšine ostatných typov mikroskopov.
Štúdium vzorky pod polarizačným mikroskopom začína inštaláciou polarizátora do osvetľovacej časti mikroskopu pod kondenzorom, vedľa apertúrnej clony. V tomto prípade je analyzátor umiestnený medzi okulárom a šošovkou - za šošovkou pozdĺž dráhy svetelných lúčov. Pri správnom nastavení takéhoto zariadenia na mikroskopovanie bude viditeľné pole po prekročení filtračných polí rovnomerne tmavé, čím sa vytvorí takzvaný extinkčný efekt. Po dokončení nastavení zariadenia sa skúmaná vzorka upevní na pódium a študuje. Stolíky polarizačných mikroskopov sú voči optickej osi vycentrované a otočné o 360 stupňov a v podobných prístrojoch na laboratórne a výskumné účely majú aj nónius. Optika a osvetľovací systém polarizačných mikroskopov je najvyššej kvality a takej výrobnej presnosti, ktorá umožňuje získať čo najčistejší obraz bez skreslenia. Sada zariadení na štúdium vzoriek v polarizovanom svetle často obsahuje kompenzátor a Bertrandovu šošovku. Prvý umožňuje efektívne študovať štruktúru minerálov a šošovka umožňuje zväčšiť a zaostriť oblasť pozorovania, keď nastanú zmeny obrazu po otočení stolíka. Dnes sú na trhu tri hlavné typy takýchto prístrojov pre mikroskopiu - už spomínané výskumné a laboratórne mikroskopy, ako aj pracovný polarizačný mikroskop.