Mikroskopia polaryzacyjna. Mikroskopia polaryzacyjna. Mikroskopia interferencyjna. Mikroskopia luminescencyjna. Technika mikroskopowa. Hodowla tkankowa, mikrochirurgia
Mikroskopia polaryzacyjna jest jedną z najpotężniejszych metod badania morfologicznego struktury i właściwości leków. Mikroskopia polaryzacyjna umożliwia badanie właściwości struktur histologicznych, które są dwójłomne.
Aby wdrożyć metodę mikroskopii polaryzacyjnej, można doposażyć dowolny mikroskop. Mikroskop wyposażony jest w dwa filtry polaryzacyjne: pierwszy umieszcza się bezpośrednio pod kondensorem, drugi pomiędzy soczewką a okiem badacza. Obracając polaryzatorem, pole widzenia zostaje przyciemnione. Lek jest umieszczony. Obracaj preparat na scenie, aż pojawią się jasno świecące struktury. Jarzenie pojawia się w momencie, gdy oś obiektu dwójłomnego znajduje się pod kątem 45° do płaszczyzny polaryzacji.
Wcześniej w mikroskopii polaryzacyjnej stosowano filtry polaryzacyjne o polaryzacji liniowej. W nowej technice zbadano możliwość diagnozowania leków za pomocą filtrów polaryzacyjnych o polaryzacji kołowej. Okazało się, że obrazy uzyskane za pomocą filtrów kołowych niosą ze sobą znacznie więcej informacji i pozwalają zidentyfikować delikatniejszą strukturę tkanek i komórek.
Badania w świetle spolaryzowanym można wykonywać na skrawkach zamrożonych lub parafinowych po odparafinowaniu, niezabarwionych i wybarwionych, zatopionych w różnych podłożach. Bloki tkanki należy pociąć i ułożyć tak, aby włókna mięśniowe danej warstwy mięśnia sercowego zostały przecięte wzdłużnie.
Miofibryle w świetle spolaryzowanym wykazują charakterystyczne prążki poprzeczne związane z naprzemiennością dysków anizotropowych (A) i izotropowych I. Dyski A mają wyraźną dodatnią dwójłomność i wydają się jasne w świetle spolaryzowanym (w zwykłym świetle są ciemne), podczas gdy dyski I są prawie całkowicie pozbawione dwójłomności i wydają się ciemne w świetle spolaryzowanym (w zwykłym świetle są jasne).
Za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej wygodnie jest zidentyfikować najbardziej uniwersalne uszkodzenie włókien mięśniowych mięśnia sercowego i mięśni szkieletowych - uszkodzenie przykurczowe (upośledzone prążkowanie poprzeczne kardiomiocytów jest jedną z wczesnych oznak uszkodzenia miofibryli).
Zwyczajowo rozróżnia się 3 etapy tych uszkodzeń:
Etap I - anizotropia wzrasta w niektórych obszarach włókien mięśniowych. II
etap - dyski A o zwiększonej anizotropii zbliżają się do siebie, w wyniku czego zmniejsza się grubość 1-dysków. III
etap - dyski A łączą się w ciągły konglomerat anizotropowy.
Wraz z urazami przykurczowymi, mikroskopia polaryzacyjna
pozwala nam zidentyfikować inny rodzaj uszkodzenia włókien mięśni poprzecznie prążkowanych - hiperrelaksację sarkomerów, która jest w dużej mierze charakterystyczna dla niedokrwienia mięśnia sercowego.
Prostota metody polaryzacyjnej pozwala przy minimalnych kosztach radykalnie zwiększyć wiarygodność diagnozy obecności zawału mięśnia sercowego.
Co do mikroskopu polaryzacyjnego. Sytuacja jest taka, że prawie każdy mikroskop da się przerobić na polaryzacyjny. Stosowane są dwa filtry polaryzacyjne (zakupione w sklepie fotograficznym) – jeden umieszcza się nad oświetlaczem, a drugi pomiędzy preparatem a obiektywem.
Utworzono referencyjną płytę CD-ROM „Polarization Microscopy”. Dysk zawiera dużą liczbę prac i materiałów dotyczących wykorzystania mikroskopii polaryzacyjnej.
Ponadto utworzono wyspecjalizowany kompleks – zautomatyzowane stanowisko kryminalistyczne. W skład kompleksu wchodzi mikroskop polaryzacyjny Nikon E200, aparat cyfrowy z 8 milionami elementów, adaptery i oprogramowanie.
Referencje: 1.
Kaktursky L.V. Mikroskopia polaryzacyjna. W książce. Technika mikroskopowa. - M.: Medycyna, 1996. 2.
Cellarius Yu.G., Semenova Los Angeles Zastosowanie mikroskopii polaryzacyjnej do diagnostyki histologicznej wczesnych stadiów niedokrwiennych i metabolicznych uszkodzeń mięśnia sercowego // Cor et vasa. - 1977 - Cz. 19. - nr 1. - s. 28-33 3.
Nepomnyashchikh L.M. Morfogeneza najważniejszych ogólnych procesów patologicznych w sercu. - Nowosybirsk: Nauka, 1991. - 352 s. 4.
Cellarius Yu.G., Semenova L.A., Nepomnyashchikh L.M. Urazy ogniskowe i zawał mięśnia sercowego. Światło, polaryzacja i mikroskopia elektronowa. - Nowosybirsk, 1980.
Więcej na ten temat Koltova N.A. NOWA METODA MIKROSKOPII POLARYZACYJNEJ W DIAGNOSTYCE ZAŁÓW MIĘŚNIA SERCA:
- PYTANIE 252: Jakie uchybienia w czynnościach zawodowych pracowników medycznych mogą stać się powodem wszczęcia sprawy karnej lub cywilnej?
- Kiriłow V.A., Bakhmetyev V.I. ZASTOSOWANIE METODY MORFOMETRYCZNEJ DO DIAGNOSTYKI RODZAJU WPŁYWU ZEWNĘTRZNEGO PRZEZ OZNAKI MORFOLOGICZNE ZNISZCZENIA KOŚCI DŁUGICH CEWKOWNIKÓW
- Mishin E.S., Podporinova E.E., Pravodelova A.O. OCENA METOD DIAGNOSTYKI USZKODZEŃ KOŚCI PODOBNEJ, krtani i tchawicy W PRZYPADKU TĘPEGO USZKODZENIA SZYI
MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA
MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA
Fizyczny słownik encyklopedyczny. - M .: Encyklopedia radziecka. . 1983 .
MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA
-
patrz art. Mikroskopia.
Encyklopedia fizyczna. W 5 tomach. - M .: Encyklopedia radziecka. Redaktor naczelny A. M. Prochorow. 1988 .
Zobacz, co oznacza „MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA” w innych słownikach:
MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA- mikroskopia, opierająca się na zdolności różnych składników komórek i tkanek do załamywania promieni spolaryzowanych. Mikroskop polaryzacyjny umożliwia badanie obiektów wykazujących dwójłomność... Słownik terminów botanicznych
Zespół metod (i urządzeń zapewniających te metody) przeznaczonych do obserwacji i badania obiektów pod mikroskopem, które pod jakimkolwiek względem zmieniają polaryzację światła (patrz Polaryzacja światła) przechodzącego przez obiekty... ...
MIKROSKOPIA POLARYZACYJNA- patrz Mikroskop, Technika mikroskopowa... Weterynaryjny słownik encyklopedyczny
Ogólna nazwa metod obserwacji obiektów nierozróżnialnych dla ludzkiego oka przez mikroskop. Więcej szczegółów znajdziesz w art. (patrz MIKROSKOP). Fizyczny słownik encyklopedyczny. M.: Encyklopedia radziecka. Redaktor naczelny A. M. Prochorow. 1983... Encyklopedia fizyczna
M. podczas oświetlania obiektu światłem spolaryzowanym; służy do wykrywania i badania obiektów lub ich struktur, które mają właściwości dwójłomne... Duży słownik medyczny
Termin mikroskopia z sondą skanującą Termin w języku angielskim mikroskopia z sondą skanującą Synonimy Skróty SPM, SPM Powiązane terminy „inteligentne” materiały, mikroskopia sił atomowych, manipulacja atomowa, wspornik, mikroskop, ... ... Encyklopedyczny słownik nanotechnologii
Metody badania różnych obiektów za pomocą mikroskopu. W biologii i medycynie metody te umożliwiają badanie struktury mikroskopijnych obiektów, których wymiary przekraczają rozdzielczość ludzkiego oka. Podstawa M.m.i. wynosi... ... Encyklopedia medyczna
- (z greckiego ἱστός tkanka i greckiego λόγος wiedza, słowo, nauka) dział biologii zajmujący się badaniem struktury tkanek organizmów żywych. Zwykle wykonuje się to poprzez pocięcie tkanki na cienkie warstwy za pomocą mikrotomu. W przeciwieństwie do anatomii, ... ... Wikipedia
Mikroskop (od mikro... i greckiego skopéo patrzę), urządzenie optyczne służące do uzyskiwania bardzo powiększonych obrazów obiektów (lub szczegółów ich budowy) niewidocznych gołym okiem. Ludzkie oko jest naturalnym układem optycznym... Wielka encyklopedia radziecka
I Mikroskop (od Mikro... i greckiego skopéo patrzę) urządzenie optyczne służące do uzyskiwania bardzo powiększonych obrazów obiektów (lub szczegółów ich budowy) niewidocznych gołym okiem. Ludzkie oko jest naturalnym... Wielka encyklopedia radziecka
Książki
- Wprowadzenie do cytochemii ilościowej. Podsumowanie ilościowych metod badania komórek i wykorzystywanego do tego sprzętu optycznego. W książce skupiono się na najbardziej wiarygodnych metodach ilościowego określania...
Mikroskopia polaryzacyjna- jedna z wysoce skutecznych metod badań morfologicznych, posiadająca szerokie możliwości identyfikacji struktur biologicznych, co w połączeniu z dostępnością i względną prostotą decyduje o jej dużej wartości. Metoda umożliwia badanie nie tylko struktury histologicznej leku, ale także niektórych jego parametrów histochemicznych. W latach 40. i 50. XX w. mikroskopię polaryzacyjną uważano za metodę ultrastrukturalną, ponieważ umożliwiała zobaczenie ultrastrukturalnych zdolności tkanek.
Mikroskopia polaryzacyjna przeznaczona jest do badania właściwości struktur histologicznych, które mają zdolność dwójłomności (anizotropii) - rozszczepienia wiązki światła podczas przejścia przez ośrodek anizotropowy. Fala świetlna w ośrodku anizotropowym rozpada się na dwie fale o wzajemnie prostopadłych płaszczyznach drgań fal elektromagnetycznych. Płaszczyzny te nazywane są płaszczyznami polaryzacji. Światło spolaryzowane różni się od światła zwykłego (niespolaryzowanego) tym, że w tym drugim fale świetlne oscylują w różnych płaszczyznach, natomiast w świetle spolaryzowanym występują tylko w określonej płaszczyźnie.
Aby uzyskać efekt polaryzacji, mikroskop polaryzacyjny wykorzystuje dwa polaroidy. Pierwszy, zwany polaryzatorem, umieszcza się pomiędzy oświetlaczem mikroskopu a preparatem histologicznym, drugi polaroid, umieszczony pomiędzy preparatem histologicznym a okiem badacza, pełni funkcję analizatora. Zarówno polaryzator, jak i analizator są optycznie dokładnie tymi samymi filtrami polaryzacyjnymi, więc można je zamieniać (jeśli pozwala na to konstrukcja mikroskopu). Wcześniej do mikroskopii polaryzacyjnej używano pryzmatów Nicolasa, Arensa lub Thomsona wykonanych z drzewca islandzkiego. Pryzmaty te miały ograniczony kąt załamania światła. Obecnie zamiast nich stosuje się płaskie filtry polaryzacyjne, wytwarzające światło spolaryzowane o szerokim polu widzenia.
W tworzeniu światła spolaryzowanego decydującą rolę odgrywa względne położenie polaryzatora i analizatora względem osi optycznej mikroskopu. Jeżeli są one zorientowane w taki sposób, że oba przepuszczają światło spolaryzowane w tej samej płaszczyźnie, tj. gdy ich płaszczyzny polaryzacji pokrywają się, oba filtry polaryzacyjne są w stanie przepuszczać światło spolaryzowane; pole widzenia mikroskopu jest jasne (ryc. 1a).
Ryż. 1 Próbka ludzkiego płuca w jasnym polu, OlympusCX41, obiektyw 10x
Jeżeli płaszczyzny polaryzacyjne filtrów polaryzacyjnych są wzajemnie prostopadłe (uzyskuje się to poprzez obrót analizatora o 90° wokół osi optycznej mikroskopu), wówczas spolaryzowane światło nie przechodzi i badacz widzi ciemne pole widzenia (ryc. 2).
Kiedy polaryzator zostanie obrócony o 360° podczas obrotu, pole widzenia zostanie dwukrotnie całkowicie przyciemnione i dwukrotnie całkowicie rozjaśnione. W przeszłości stosowano filtry kompensacyjne Bernauera, które wytwarzały czerwonawy odcień w ciemnym polu widzenia ( U-TP530 ). Gdy używane są filtry z czarnym lustrem, przyciemnione pole widzenia nie wydaje się całkowicie ciemne, ale raczej słabo oświetlone.
Ryc. 2 Próbka ludzkiego płuca w świetle spolaryzowanym, obiektyw 10x
W przypadku, gdy przy skrzyżowanym położeniu filtrów polaryzacyjnych (tj. w ortoskopii) na drodze światła spolaryzowanego napotykane są substancje anizotropowe zawarte w preparacie histologicznym, substancje te rozdzielają spolaryzowane światło na dwie wiązki o wzajemnie prostopadłych płaszczyznach drgań światła fale. Przez analizator przechodzą promienie świetlne o płaszczyźnie drgań pokrywającej się z płaszczyzną polaryzacji, a te o płaszczyźnie prostopadłej zostają odcięte, w wyniku czego natężenie strumienia świetlnego wpadającego do oka badacza i docierającego do aparatu wynosi tylko połowę intensywność pierwotnej wiązki światła. W wyniku opisanych procesów substancje anizotropowe znajdujące się pomiędzy dwoma skrzyżowanymi polaryzatorami są widoczne na ciemnym tle w postaci jasnych, świecących obiektów. Jednocześnie struktury izotropowe, które nie mają zdolności dwójłomności, pozostają ciemne.
To również ma wpływ na wybór kamery do mikroskopii polaryzacyjnej. Ponieważ zadaniem jest uchwycenie małych, jasnych sygnałów na ciemnym tle, zwykle kamera do mikroskopii w jasnym polu może nie wystarczyć ze względu na małą czułość kamery i dużą ilość szumu generowanego podczas nagrywania. Do mikroskopii polaryzacyjnej Wymagana jest kamera mikroskopowa o wysokiej czułości i dokładnym odwzorowaniu kolorów. Preferowane jest stosowanie kamer opartych na matrycach CCD (VZ-CC50S), jednakże na obecnym etapie można stosować także budżetowe wersje kamer opartych na matrycach CMOS serii Sony IMX (,).
Tkanki biologiczne zawierają wystarczającą liczbę struktur anizotropowych: elementy aparatu kurczliwego mięśni, amyloid, kwas moczowy, formacje kolagenu, niektóre lipidy, wiele kryształów itp.
Promienie świetlne rozszczepiające się w obiekcie anizotropowym i przechodzące przez analizator charakteryzują się nierównymi prędkościami propagacji fal. W zależności od wielkości tej różnicy (tzw wartość opóźnienia wiązki światła) i ze względu na różnice w absorpcji światła w analizatorze, blask obiektów anizotropowych może być biały lub kolorowy. W tym drugim przypadku mówimy o zjawisku dichroizmu ( podwójna absorpcja I). Podczas badania w polu spolaryzowanym efekty kolorystyczne są wytwarzane na przykład przez wiele kryształów.
Proces dwójłomności można wzmocnić poprzez zastosowanie pewnych barwników, których cząsteczki mają zdolność orientowanego osadzania się na strukturach anizotropowych. Reakcje histochemiczne, w wyniku których powstaje efekt anizotropii, nazywane są reakcjami topooptycznymi (G. Romhanyi). Istnieją dwa rodzaje takich reakcji - addytywny i odwrotny. W przypadku reakcji addytywnych zwiększa się opóźnienie wiązki światła, co nazywa się anizotropią dodatnią, w przypadku reakcji odwrotnych maleje - anizotropia ujemna.
SPRZĘT I WYPOSAŻENIE
Mikroskopię polaryzacyjną przeprowadza się za pomocą specjalnych mikroskopów polaryzacyjnych. Jako przykład możemy wymienić importowane mikroskopy. Większość nowoczesnych mikroskopów optycznych wyposażona jest w akcesoria do mikroskopii polaryzacyjnej.
Do mikroskopii polaryzacyjnej można używać dowolnego mikroskopu świetlnego laboratoryjnego lub badawczego. Wystarczą dwa filtry polaryzacyjne, z których jeden, pełniący funkcję polaryzatora, umieszczony jest pomiędzy źródłem światła a preparatem, a drugi, pełniący rolę analizatora, umieszczony jest pomiędzy preparatem a okiem badacza. Polaryzator można wbudować w kondensator lub umieścić pod nim nad przesłoną polową, a analizator można umieścić w szczelinie rewolweru lub we wkładce pośredniej.
Na ryc. Rysunek 3 przedstawia schematyczny diagram mikroskopu polaryzacyjnego. Oprócz elementów wspólnych dla wszystkich mikroskopów świetlnych, mikroskop polaryzacyjny ma dwa filtry polaryzacyjne (polaryzator, zwykle umieszczony pod kondensorem i analizator umieszczony w okularze), a także kompensator. Analizator musi się obracać, a do określenia stopnia obrotu wymagana jest odpowiednia skala stopniowana.
Mikroskop polaryzacyjny wykorzystuje źródło światła zapewniające dużą gęstość wiązki światła. Jako źródło tego typu zaleca się stosować lampę o mocy 100 W i napięciu 12 V. Do niektórych rodzajów badań wymagane jest światło monochromatyczne. W tym celu stosuje się metalowy filtr przeciwzakłóceniowy, który najlepiej umieścić nad lustrem. Przed polaryzatorem, czyli tzw. matowym szkłem, umieszcza się rozpraszające światło matowe szkło. między nim a źródłem światła, ale w żadnym wypadku za polaryzatorem, ponieważ zakłóci to działanie filtra polaryzacyjnego.
W przeszłości w mikroskopii polaryzacyjnej używano obiektywów achromatycznych bez napięcia wewnętrznego, ale obecnie są one rzadkie. Obecnie w mikroskopach polaryzacyjnych stosuje się wyłącznie obiektywy planarno-achromatyczne, które nie posiadają napięć wewnętrznych. Soczewki apochromatyczne można stosować tylko w przypadkach, gdy podczas mikrofotografii wymagane jest normalne odwzorowanie kolorów.
Mikroskopy polaryzacyjne wyposażone są w stolik obrotowy, którego położenie względem osi optycznej można zmieniać. Kąt obrotu stołu mierzony jest za pomocą skali stopni zaznaczonej na jego obwodzie. Jednym z warunków efektywnego wykorzystania mikroskopii polaryzacyjnej jest staranne ustawienie stolika obrotowego za pomocą śrub centrujących.
Ważnym elementem mikroskopu polaryzacyjnego jest kompensator umieszczony pomiędzy obiektywem a analizatorem, zwykle w tubusie mikroskopu. Kompensator to płyta wykonana ze specjalnych rodzajów gipsu, kwarcu lub miki. Pozwala zmierzyć różnicę w drodze rozdzielonych promieni świetlnych wyrażoną w nanometrach. Działanie kompensatora zapewnia jego zdolność do zmiany różnicy w drodze promieni świetlnych, zmniejszając ją do zera lub zwiększając ją do maksimum. Osiąga się to poprzez obrót kompensatora wokół osi optycznej.
TECHNIKA MIKROSKOPII W ŚWIETLE POLARYZOWANYM
Wygodniej jest przeprowadzić mikroskopię polaryzacyjną w zaciemnionym pomieszczeniu, ponieważ intensywność strumienia świetlnego wpadającego do oka badacza jest zmniejszona 2 razy w porównaniu z pierwotnym. Po włączeniu oświetlacza mikroskopu należy w pierwszej kolejności uzyskać jak najjaśniejsze oświetlenie pola widzenia obracając polaryzator lub analizator. To położenie filtrów polaryzacyjnych odpowiada zbieżności ich płaszczyzn polaryzacji. Lek umieszcza się na scenie i najpierw bada w jasnym polu. Następnie obracając polaryzator (lub analizator) pole widzenia przyciemnia się maksymalnie; to położenie filtra odpowiada prostopadłemu ułożeniu płaszczyzn polaryzacji. Aby ujawnić efekt anizotropii, konieczne jest połączenie płaszczyzny polaryzacji obiektu anizotropowego z płaszczyzną światła spolaryzowanego. Empirycznie osiąga się to poprzez obrót stolika obiektowego wokół osi optycznej. Jeżeli do mikroskopii polaryzacyjnej używany jest mikroskop świetlny, który nie jest wyposażony w stolik obrotowy, wówczas preparat histologiczny należy obracać ręcznie. Jest to dopuszczalne, ale w tym przypadku nie można przeprowadzić niektórych rodzajów mikroskopii polaryzacyjnej, które wymagają oceny ilościowej (określenie znaku dwójłomności, wielkości różnicy w drodze promieni świetlnych).
Jeżeli obiekty anizotropowe w próbce są uporządkowane (np. anizotropowe krążki włókien mięśni poprzecznie prążkowanych), wygodnie jest je badać w ustalonym położeniu stołu, w którym obiekty te dają maksymalną luminescencję na ciemnym tle . Jeśli struktury anizotropowe są rozmieszczone chaotycznie w preparacie (na przykład kryształy), wówczas podczas ich badania należy stale obracać scenę, aby uzyskać blask tej lub innej grupy obiektów.
Aby przeprowadzić bardziej dogłębną analizę i ocenę reakcji topooptycznych, konieczna jest znajomość metodologii wyznaczania względnego znaku dwójłomności, wielkości różnicy drogi promieni oraz wskaźnika (współczynnika) refrakcja.
Znak dwójłomności charakteryzuje stopień i kierunek przemieszczenia ścieżki promieni świetlnych przechodzących przez analizator. To przesunięcie jest spowodowane barwnikami topooptycznymi, a jeśli ma na celu zmniejszenie różnicy w drodze promieni, mówi się o ujemnym znaku dwójłomności ( anizotropia ujemna), jeśli pomaga to zwiększyć różnicę w drodze promieni, wówczas stwierdza się dodatni znak dwójłomności ( dodatnia anizotropia). Jeśli zniknie różnica w drodze promieni, efekt anizotropii wyrównuje się.
Znak dwójłomności wyznacza się za pomocą kompensatora. Procedura jego użycia jest następująca. Badany obiekt umieszcza się w pozycji, w której w ciemnym polu widzenia osiągana jest maksymalna luminescencja struktur anizotropowych. Płytka kompensatora RI obracana jest wokół osi optycznej pod kątem +45° względem płaszczyzny polaryzacji analizatora. Obiekt w zależności od różnicy w drodze promieni świetlnych, która może wynosić od 20 do 200 nm, przybiera barwę niebieską lub żółtą. W pierwszym przypadku znak dwójłomności jest dodatni, w drugim - ujemny. Należy pamiętać, że w przypadku ustawienia kompensatora pod kątem +45° całe tło zaciemnionego pola widzenia ma czerwony odcień.
Można także zastosować kompensator λ/4 (U-TP137). Procedura jego użycia jest taka sama, tylko pole widzenia ma szary odcień, a nie czerwony, a obiekt świeci dodatnim znakiem załamania i jest przyciemniany znakiem ujemnym.
Ilościowe określenie różnicy dróg promieni świetlnych wyrażonej w nanometrach przeprowadza się za pomocą kompensatora Braque'a Köhlera. Aby to zrobić, użyj wzoru:
Γ=Γλ×sinφ
gdzie λ jest stałą zaznaczoną na kompensatorze przez producenta, φ jest kątem obrotu kompensatora względem płaszczyzny polaryzacji analizatora.
Współczynnik załamania światła obiektu anizotropowego wyznacza się poprzez porównanie go (pod mikroskopem) z umieszczonym obok przedmiotem testowym. Obiektami badań są ciecze wzorcowe o znanym współczynniku załamania światła. Obiekt i próbka ustawiane są obok siebie na scenie. Kiedy ich współczynniki załamania światła nie są zgodne, pomiędzy obiektem a próbką widoczna jest jasna linia zwana linią Becka. Podniesienie tubusu mikroskopu względem położenia ogniskowego powoduje przesunięcie linii Becka w stronę ośrodka, co daje wyraźniejszy efekt załamania światła. Kiedy współczynniki załamania obiektu i próbki pokrywają się, linia Becka znika. Zazwyczaj współczynnik załamania światła wyznacza się w świetle monochromatycznym dla linii sodowej widma (przy długości fali 589 nm i temperaturze 20°C). Refrakcję należy wyznaczać dla dwóch wzajemnie prostopadłych płaszczyzn polaryzacji. W tym celu wyjmuje się analizator i rejestruje załamanie obiektu w jego dwóch wzajemnie prostopadłych położeniach. Różnica między obydwoma współczynnikami załamania światła (ng - nk) charakteryzuje siłę załamania światła.
CECHY PRZETWARZANIA MATERIAŁU I PRZYGOTOWANIA PREPARATU
Utrwalanie materiału do mikroskopii polaryzacyjnej w kwaśnej formalinie jest niepożądane, gdyż pigment formalinowy powstający w wyniku oddziaływania hemoglobiny tkankowej z kwaśnym formaldehydem ma właściwości anizotropowe i utrudnia badanie preparatów w świetle spolaryzowanym. G. Scheuner i J. Hutschenreiter (1972) zalecają stosowanie w tym celu 10% obojętnej formaliny, roztworu wapniowo-formolowego Bakera i płynu Carnoya.
Czas utrwalania w 10% obojętnej formalinie wynosi 24 - 72 godziny w temperaturze 4°C, w roztworze wapniowo-formolowym Bakera - 16 - 24 godziny w temperaturze 4°C. Utrwalanie w formolu wapniowym jest szczególnie korzystne przy badaniu związków lipidowo-białkowych. Płyn Carnoy'a szybko nasyca tkaniny. Elementy o grubości 1 - 2 mm można profilować już po 1 godzinie w temperaturze 4°C. Utrwalanie w płynie Carnoya nie nadaje się do badań lipidów. Ponadto stosuje się płyn Zenkera, zwłaszcza impregnowany solami złota i srebra. Po potraktowaniu mieszaniną płynu Zenkera i kwasu octowego czerwone krwinki nabywają zdolność do ulegania dwójłomności.
Podczas badania gęstych tkanek (kości, zębów) pod mikroskopem polaryzacyjnym, oprócz odwapnienia kwasem, wymagana jest dodatkowa obróbka w celu usunięcia włókien kolagenowych. W tym celu skrawki takich tkanek gotuje się przez kilka minut w mieszaninie gliceryny i wodorotlenku potasu (10 ml gliceryny i 2 ziarenka wodorotlenku potasu) aż do całkowitego wybielenia, następnie ostrożnie odsącza się alkalia, skrawki przemywa się wodą i przeniesiono pęsetą na stolik mikroskopu.
Do mikroskopii polaryzacyjnej stosuje się skrawki parafinowe, mrożone i kriostatowe. Niezabarwione, zamrożone skrawki przeznaczone do badania w świetle spolaryzowanym zatapia się w glicerynie. Nieutrwalone skrawki kriostatu nadają się do analizy mikroskopowej polaryzacyjnej bezpośrednio po przygotowaniu. Ze względu na dużą wrażliwość na szkodliwe działanie różnych czynników środowiskowych, nadal zaleca się utrwalanie tych odcinków w 10% obojętnym roztworze formaldehydu lub wapniowo-formolowym.
Na wyniki mikroskopii polaryzacyjnej wpływa grubość skrawków histologicznych. Podczas badania grubych przekrojów tworzone są warunki do nakładania się na siebie różnych struktur anizotropowych. Ponadto przy różnych grubościach plasterków właściwości anizotropowe badanych struktur mogą się zmieniać, dlatego bardzo ważne jest, szczególnie w badaniach porównawczych, zapewnienie stałej grubości plasterka. Zalecana maksymalna grubość skrawków nie powinna przekraczać 10 µm.
Kolejnym obowiązkowym warunkiem jest ostrożne odparafinowanie skrawków, ponieważ nieusunięte pozostałości parafiny dają wyraźny efekt anizotropii, co komplikuje badanie. Parafina szczególnie długo utrzymuje się na czerwonych krwinkach i jądrach komórkowych. W celu całkowitego usunięcia parafiny ze skrawków zaleca się wykonanie następującej obróbki.
- Ksylen 30 min
- Alkohol 100% 5 min
- Mieszanina metanolu i chloroformu (1:1) w temperaturze 50°C przez 24 godziny
- Alkohol 100% 5 min
- Alkohol 70% 10 min Woda
Należy także pamiętać, że skrawki poddawane mikroskopii polaryzacyjnej nie powinny mieć kontaktu z fenolami (np. nie należy ich oczyszczać w ksylenie karbolowym).
Bardziej szczegółowe informacje na temat mikroskopii polaryzacyjnej i stosowania kompensatorów można uzyskać pod linkiem (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Jeżeli mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące mikroskopii polaryzacyjnej, prosimy o kontakt ze Szkołą Mikroskopii.
Metoda mikroskopii z kontrastem fazowym
Większość struktur komórkowych różni się nieznacznie współczynnikiem załamania światła i pochłanianiem promieni od siebie i otoczenia. Aby zbadać takie elementy, należy zmienić oświetlenie (z utratą przejrzystości obrazu) lub zastosować specjalne metody i instrumenty. Jedną z nich jest metoda mikroskopii z kontrastem fazowym. Jest szeroko stosowany w istotnych badaniach komórek. Istota metody polega na tym, że nawet przy bardzo małych różnicach współczynników załamania światła poszczególnych elementów preparatu, przechodząca przez nie fala świetlna ulega różnym zmianom fazowym. Niewidoczne bezpośrednio ani dla oka, ani dla kliszy fotograficznej, te zmiany fazowe przekształcają się za pomocą specjalnego urządzenia optycznego w zmiany amplitudy fali świetlnej, czyli w zmiany jasności, które są już widoczne dla oka lub zarejestrowane na światłoczułym warstwa. W powstałym widzialnym obrazie rozkład jasności (amplituda) odtwarza relief fazowy. Uzyskany w ten sposób obraz nazywa się kontrastem fazowym. Obiekty mogą wydawać się ciemne na jasnym tle (dodatni kontrast fazowy) lub jasne na ciemnym tle (ujemny kontrast fazowy).
Metoda kontrastu interferencyjnego (mikroskopia interferencyjna)
Metoda kontrastu interferencyjnego jest podobna do poprzedniej - obie opierają się na interferencji promieni przechodzących przez mikrocząstkę i przechodzących przez nią. Wiązka równoległych promieni świetlnych wychodzących z oświetlacza rozdziela się na dwa strumienie, gdy dociera do mikroskopu. Jeden z powstałych promieni kierowany jest przez obserwowaną cząstkę i uzyskuje zmiany w fazie drgań, drugi – omija obiekt wzdłuż tej samej lub dodatkowej gałęzi optycznej mikroskopu. W części okularowej mikroskopu obie wiązki są ponownie połączone i zakłócają się nawzajem. W wyniku interferencji powstanie obraz, w którym obszary komórki o różnej grubości lub różnej gęstości będą się od siebie różnić stopniem kontrastu. Metodę kontrastu interferencyjnego często stosuje się w połączeniu z innymi metodami mikroskopowymi, w szczególności z obserwacją w świetle spolaryzowanym. Jej zastosowanie w połączeniu z mikroskopią ultrafioletową umożliwia m.in. określenie zawartości kwasów nukleinowych w całkowitej suchej masie obiektu.
Mikroskopia polaryzacyjna
Mikroskopia polaryzacyjna to metoda obserwacji obiektów izotropowych, czyli w świetle spolaryzowanym. uporządkowana orientacja cząstek submikroskopowych. Polaryzator umieszcza się przed kondensorem mikroskopu polaryzacyjnego, który przepuszcza fale świetlne o określonej płaszczyźnie polaryzacji. Za próbką i obiektywem umieszcza się analizator, który może przepuszczać światło o tej samej płaszczyźnie polaryzacji. Jeżeli następnie obrócimy analizator o 90° w stosunku do pierwszego, wówczas światło nie będzie przez niego przepuszczane. W przypadku, gdy pomiędzy tak skrzyżowanymi pryzmatami znajdzie się obiekt mający zdolność polaryzacji światła, będzie on widoczny jako świecący w ciemnym polu. Za pomocą mikroskopu polaryzacyjnego można sprawdzić np. zorientowane ułożenie miceli w ścianie komórkowej roślin.
Załóżmy, że masz parę uszkodzonych okularów polaryzacyjnych (polaryzatorów). Jeśli weźmiesz jedną szklankę i obrócisz ją względem drugiej, zapadnie ciemność. Stopień nieprzezroczystości zależy od jakości polaryzatorów.
Tłumienie 95-98% światła jest doskonałe; jeśli jest znacznie mniejszy, pojawia się brudno-szary odcień.Względne położenie polaryzatorów przy uzyskiwaniu ciemnego pola nazywa się skrzyżowanym, przy uzyskiwaniu najjaśniejszego zera - równoległym.
Zanim przejdziemy do mikroskopii polaryzacyjnej, wróćmy do wspomnianego powyżej patologa.
Dodajmy do jego mikroskopu z jasnym polem lub kontrastem fazowym pomiędzy przystawką lornetkową a korpusem mikroskopu urządzenie, które umożliwi wprowadzenie elementu polaryzującego (analizatora) do ścieżki optycznej. Umieśćmy pod kondensatorem kolejny element polaryzujący (polaryzator) i kręćmy nim aż do uzyskania całkowitej ciemności (skrzyżowanie analizatora i polaryzatora); Ustalmy ich stanowisko. Włóżmy do tego urządzenia (pomiędzy nasadkę lornetki a korpus mikroskopu) wysuwany uchwyt z kompensatorem - czerwoną płytkę pierwszego rzędu. Załóżmy, że patolog bada próbkę tkanki i zauważa obiekt wyglądający jak kryształ. Instaluje analizator, ustawia polaryzator w pozycję skrzyżowaną i bada obiekt. Jeśli jest to kryształ lub formacja krystaliczna, świeci tak, jakby za półprzezroczystym ekranem włączono światło. Patolog nie jest jeszcze w stanie określić, czy jest to kryształ kwasu moczowego, czy wapnia. Wprowadza czerwoną płytkę pierwszego rzędu w przebieg promieni i obraca ją z jednego ustalonego położenia do drugiego: kryształ staje się albo czerwony, albo zielony. W ten sposób można określić charakter kryształu. Następnie patolog zdejmuje analizator i, w razie potrzeby, polaryzator z toru optycznego i kontynuuje pracę (badany obszar próbki pozostaje w polu widzenia).
Skupmy się teraz na mikroskopie polaryzacyjnym. Zawiera wiele elementów obecnych w konwencjonalnym mikroskopie z jasnym polem, ponieważ polega na badaniu próbki w jasnym polu pomiędzy elementami polaryzującymi.
Dość często, szczególnie podczas nauczania studentów, stosuje się monokularowe mikroskopy polaryzacyjne ze względu na ich niski koszt. Profesorowie preferują modele lornetkowe. Głowicę lornetkową można wyposażyć w stałą lub skupiającą soczewkę Bertranda, niezbędną do badań
(jego funkcje opisano poniżej). Pomiędzy dyszą a korpusem znajduje się część, w której znajduje się analizator oraz szczelina do montażu kompensatora.
Mikroskop posiada okrągły, obrotowy stolik, który umożliwia badanie preparatu poprzez obracanie go pomiędzy analizatorem skrzyżowanym a polaryzatorem. Stół wyposażony jest także w skalę umożliwiającą pomiar jego obrotu w stopniach i minutach kątowych. Pod stolikiem obiektowym (zwykle pod kondensorem) znajduje się obrotowy polaryzator, którego położenie jest ustalone na 0, 45° i 90° w stosunku do położenia analizatora. Oczywiście mikroskop wyposażony jest w przysłonę aperturową i z reguły uchwyt na filtr.
Okular nasadki jedno- lub dwuokularowej ma celownik. Całe centrowanie odbywa się względem tego krzyża nitkowego, preparat również obraca się wokół środka tego krzyża nitkowego.
Różnica między stolikiem mechanicznym polega na tym, że musi on być umieszczony nisko, aby soczewki nie uderzały w niego podczas obracania. Bardzo często jest to stół pomiarowy, który przy przesuwaniu w kierunku wschód-zachód lub północ-południe jest sekwencyjnie ustalany w określonych odstępach. Wyobraź sobie kulkę, która wpada w rowek – tak działa mechanizm mocowania. Możesz wziąć przedmiot ostrzejszy niż piłka - efekt będzie taki sam. Podczas obracania soczewek mechanizm blokujący utrzymuje każdą soczewkę na drodze optycznej promieni.
Aby policzyć różne składniki na cienkim wycinku, przypisuje się im numery na liczniku od 1 do 9. Liczba 10 oznacza emisję lub sumowanie. Badacz przesuwa preparat, aż stół zostanie unieruchomiony i sprawdza, czy jeden z 9 składników znajduje się na celowniku. Jeśli żadnego z nich nie ma, wybierz liczbę 10. Licząc materiał na ladzie, musisz wskazać liczbę każdego ze składników, a wszystko inne pod numerem 10. Po obejrzeniu całego preparatu możesz obliczyć procent którykolwiek z 9 składników materiału.
Kompensator montowany jest w mikroskopie pod kątem 45° w kierunku północ-południe i wschód-zachód.
Większość elementów jest widoczna tak samo niezależnie od ich ułożenia względem kompensatora, jednak niektóre wymagają obrotu, co jest kolejnym powodem, dla którego stolik musi być obrotowy. Nie będziemy szczegółowo omawiać funkcji różnych kompensatorów czy klinów, gdyż można zakupić specjalną książkę na ten temat. Wymienimy tylko niektóre nazwy: płytka o długości fali 1/4 - klin kwarcowy, który może mieć 6, 30 lub 120 rzędów; płyta czerwona pierwszego rzędu (posiada trzy inne nazwy wskazujące wiek korzystających z niej: płyta wolno świecąca, płyta czuła i płyta gipsowa, najstarsza).
Rozważmy pojęcie „porządku”. Kiedy światło załamuje się przez pryzmat, wszystkie kolory widma stają się widoczne, a następnie stają się jaśniejsze (trzeci, czwarty itd. zestawy porządków kolorów). Porządek zerowy to światło czarne na samym początku widma. Czerwona płytka pierwszego rzędu, jak sama nazwa wskazuje, jest odpowiednikiem czerwieni w pierwszym rzędzie kolorów.
Soczewka Bertranda w połączeniu z okularem stanowi pomocniczy tubus celowniczy, który umożliwia obserwację wielkości interferencyjnych w źrenicy wyjściowej mikrosoczewki, podczas gdy sam mikroskop skupia się na konkretnym ziarnie preparatu. Jeśli geolog musi zidentyfikować materiał, obraca cienki fragment minerału między skrzyżowanym polaryzatorem a analizatorem. Widoczne są w tym przypadku 2 kolory (i tylko 2), a do przekształcenia jednego koloru w drugi potrzebny jest określony kąt obrotu preparatu. Większość minerałów można zidentyfikować w ten sposób. Jednak niektóre minerały są tak podobne pod względem koloru i kąta rotacji, że jedynym sposobem ich identyfikacji są wzory interferencyjne.
Petrografia bada geologię ropy naftowej. Mikroskop petrograficzny nie posiada soczewki Bertranda, ponieważ jego użytkownicy nie potrzebują wzoru interferencyjnego.
Standardowe prace geologiczne wykonywane są na cienkich przekrojach. Składa się z cienkiego odcinka kamienia, oszlifowanego, osadzonego w żywicy epoksydowej na szkiełku szklanym o wymiarach 1 x 2 cale, a następnie ponownie przeszlifowanego tak, aby grubość odcinka nie przekraczała 15 mikronów; Następnie preparat umieszcza się na stoliku i przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Preparaty takie obserwuje się w świetle padającym z polaryzatora przez cienki przekrój.
Wszystkie tego typu badania odnoszą się do mikroskopu jasnego pola, do którego dodawany jest polaryzator, analizator i kompensator.
Badacz rudy może rozpocząć przygotowanie próbki w taki sam sposób, jak cienki przekrój, nadając jej grubość 6-10 mm i szlifując powierzchnię. Wymagać będzie epi-iluminacji, dlatego pomiędzy głowicą lornetki a korpusem mikroskopu należy umieścić oświetlacz. Będzie zarówno żarówka, jak i transformator; polaryzator, analizator, kompensator; przysłony aperturowe i polowe, zwierciadła dichroiczne itp. D.
Soczewki z polaryzacją światła działają inaczej niż soczewki standardowe. Najważniejsze, że muszą być wolne od wewnętrznych napięć. Naprężenia w soczewkach powstają w wyniku dociskania metalowych oprawek do krawędzi soczewki. Obserwuje się to pod mikroskopem jako błysk białego światła wychodzącego z punktu nacisku w kierunku środka.
Producenci dokładnie sprawdzają soczewki pod kątem napięcia wewnętrznego. Soczewki, które nie mają napięcia, są dostarczane z mikroskopami polaryzacyjnymi po wysokiej cenie; a soczewki z napięciem zaliczane są do mikroskopów biologicznych, w których napięcie nie odgrywa żadnej roli lub są całkowicie odrzucane.
Pokazaliśmy, że nasze soczewki są potrzebne. Obiektywy te zostały zaprojektowane i przystosowane do pracy z próbkami o grubości poniżej 0,17 mm.
Podczas badania rudy pod mikroskopem wypolerowana powierzchnia nie jest przykryta szkiełkiem nakrywkowym. Do takich prac potrzebujemy soczewek, które nie będą dopasowane względem szkiełek nakrywkowych, lub soczewek do metalografii, ale bez napięcia.
Obiektywów 10x można używać z szkiełkami nakrywkowymi lub bez nich. Mikroskopy do rud będą wymagały obiektywów o powiększeniu 20x lub silniejszym, skorygowanych pod kątem braku szkiełka nakrywkowego.
Nasz standardowy mikroskop polaryzacyjny jest zwykle wyposażony w obiektywy 5x, 10x i 40x. Rewolwer posiada 4 gniazda na obiektywy, dlatego dodaliśmy drugi obiektyw 40x do szkiełek bez szkiełka nakrywkowego, tworząc w ten sposób mikroskop polaryzacyjny z podwójnym światłem. Wcześniej przy opisie okularów Huygensa w notatce było napisane, że nie zapewniają one korekcji barw ani kompensacji aberracji chromatycznej i aby rozwiązać ten problem należy zapoznać się z rozdziałem „Mikroskopia polaryzacyjna”.
Kiedy już ustalimy znaczenie kolorów, nie chcemy, aby okular czy soczewka generowały w polu widzenia kolory, które nie należą do preparatu. Wiemy, że do mikroskopów polaryzacyjnych wybrano soczewki beznaprężeniowe ze względu na brak napięcia i korekcję barwy. Dlatego bardzo ważne jest, aby okulary również nie posiadały korekcji ani kompensacji kolorów. Z tego powodu okulary polaryzacyjne są zwykle modyfikowane na okulary Huygens. Czasami używane są również okulary o szerokim polu widzenia, ale specjalnie testowane pod kątem zgodności z mikroskopem polaryzacyjnym.
Zachowaj ostrożność przy obliczaniu całkowitego powiększenia mikroskopu polaryzacyjnego. Ze względu na wysokość urządzenia służącego do montażu analizatora i kompensatora, dodatkowo zwiększa się mocowanie lornetki. Przykładowo mikroskop wyposażony w rewolwer na 3 soczewki ma dodatkowe powiększenie 1,4x, a mikroskop z rewolwerem na 4 soczewki ma dodatkowe powiększenie 1,8x.
Na ryc. Rysunek 10 przedstawia ogólny widok mikroskopu polaryzacyjnego.
1. Okular szerokokątny 10x z dużym odstępem źrenicy
2. Soczewka Bertranda
3. Szczelina na kompensator
4. Mikrosoczewki pozbawione naprężeń
5. Stopień obrotowy ze skalą na tarczy; cena podziału 1°
6. Skraplacz
7. Polaryzator obrotowy z możliwością usuwania promieni z drogi
8. Przesłona irysowa polowa
9. Okular skupiający 10x z prowadnicą i krzyżem nitkowym
10. Głowica lornetkowa z możliwością obrotu o 360° i kątem nachylenia 30° względem osi optycznej
11. Śruba mocująca lornetkę
12. Uchwyt analizatora
13. Rewolwer z mikrosoczewkami
14. Stojak na mikroskop
15. Klipsy do mocowania narkotyków
16. Regulacja wysokości wspornika skraplacza
17. Współosiowo umieszczone mechanizmy zgrubnego i dokładnego ustawiania ostrości
18. Podstawa mikroskopu z wbudowanym transformatorem i regulacją jasności lampy halogenowej 6 V, 30 W.