Mikroskopia polaryzacyjna. Wizualizacja struktur wewnątrzkomórkowych mikroorganizmów za pomocą mikroskopii świetlnej. Metoda mikroskopii z kontrastem fazowym
Mikroskopia polaryzacyjna pozwala uzyskać obrazy niewybarwionych struktur anizotropowych (np. włókien kolagenowych, miofibryli czy komórek drobnoustrojów). Zasada metody opiera się na badaniu obiektu w świetle utworzonym przez dwie wiązki spolaryzowane we wzajemnie prostopadłych płaszczyznach.
Ryż. 11-4. Schemat mikroskopu fluorescencyjnego.Mikroskopia interferencyjna
Mikroskopia interferencyjnałączy w sobie zasady mikroskopii kontrastowo-fazowej i mikroskopii polaryzacyjnej. Metoda służy do uzyskania kontrastowego trójwymiarowego obrazu niepomalowanych obiektów. Zasada metody opiera się na rozszczepieniu strumienia światła w mikroskopie; jeden promień przechodzi przez obiekt, drugi - obok niego. Obie wiązki są połączone w okularze i wzajemnie zakłócają się.
Ryż. 11-5. Immunofluorescencja bezpośrednia. Metoda bezpośrednia polega na zastosowaniu AT znakowanego barwnikiem fluorescencyjnym do Ag będącego przedmiotem zainteresowania; AT oddziałuje z Ag w miejscach ich lokalizacji, co pozwala na wizualizację etykiety.
Mikroskopia fluorescencyjna
Metoda mikroskopii fluorescencyjnej opiera się na zdolności niektórych substancji do świecenia pod wpływem promieniowania krótkofalowego. W tym przypadku emitowane fale świetlne są dłuższe niż fala powodująca świecenie. Innymi słowy, obiekty fluorescencyjne pochłaniają światło o jednej długości fali i emitują światło w innym obszarze widma (ryc. 11-4). Na przykład, jeśli indukujące promieniowanie jest niebieskie, powstały blask może być czerwony lub żółty. Substancje te (izocyjanian fluoresceiny, oranż akrydynowy, rodamina itp.) są stosowane jako barwniki fluorescencyjne do obserwacji obiektów fluorescencyjnych (luminescencyjnych). W mikroskopie fluorescencyjnym światło ze źródła (lampa rtęciowa o bardzo wysokim ciśnieniu) przechodzi przez dwa filtry.
Ryż. 11-6. Immunofluorescencja pośrednia. Metoda pośrednia polega na wykorzystaniu dwóch różnych terminali AT. Pierwsze AT reagują z Ag mikroorganizmu, drugie AT (związane ze znacznikiem) specyficznie oddziałują z pierwszymi AT, które są Ag dla drugich AT. Metoda jest znacznie bardziej czuła niż immunofluorescencja bezpośrednia, ponieważ kilka cząsteczek drugiego AT wiąże się z każdą cząsteczką pierwszego AT.
Pierwszy (niebieski) filtr zatrzymuje światło przed próbką i przepuszcza światło o długości fali, która wzbudza fluorescencję próbki. Drugi (żółty) blokuje światło niebieskie, ale przepuszcza żółte, czerwone i zielone światło emitowane przez obiekt fluorescencyjny i postrzegane przez oko. Zazwyczaj badane mikroorganizmy barwi się bezpośrednio lub przy użyciu AT lub lektyn znakowanych fluorochromami. Leki oddziałują z Ag lub innymi strukturami obiektu wiążącymi ligand. Mikroskopia fluorescencyjna znalazła szerokie zastosowanie do wizualizacji wyników reakcji immunochemicznych opartych na specyficznym oddziaływaniu AT znakowanego barwnikami fluorescencyjnymi z Ag badanego obiektu. Opcje reakcje immunofluorescencyjne są przedstawione na ryc. 11-5 i 11-6.
Wyślij swoją dobrą pracę do bazy wiedzy jest prosta. Skorzystaj z poniższego formularza
Studenci, doktoranci, młodzi naukowcy, którzy wykorzystują bazę wiedzy w swoich studiach i pracy, będą Państwu bardzo wdzięczni.
Wysłany dnia http://www.allbest.ru/
Wstęp
Mikroskopia świetlna
Mikroskopia elektronowa
Mikroskopia polaryzacyjna
Aneks 1
Mikroskopia świetlna
Mikroskopia świetlna jest najstarszą i jednocześnie jedną z najpowszechniejszych metod badania i badania komórek roślinnych i zwierzęcych. Zakłada się, że początek badań komórek nastąpił właśnie wraz z wynalezieniem mikroskopu optycznego. Główną cechą mikroskopu świetlnego jest rozdzielczość mikroskopu świetlnego, która jest określona przez długość fali światła. Granica rozdzielczości mikroskopu świetlnego zależy od długości fali światła; mikroskop optyczny służy do badania struktur, których minimalne wymiary są równe długości fali promieniowania świetlnego. Wiele komórek składowych ma podobną gęstość optyczną i wymaga wstępnej obróbki przed wykonaniem mikroskopii, w przeciwnym razie są praktycznie niewidoczne pod konwencjonalnym mikroskopem świetlnym. Aby je uwidocznić stosuje się różne barwniki o określonej selektywności. Stosując barwniki selektywne, możliwe staje się bardziej szczegółowe badanie wewnętrznej struktury komórki.
Na przykład:
barwnik hematoksylinowy barwi niektóre składniki jądra na niebiesko lub fioletowo;
po traktowaniu kolejno floroglucynolem, a następnie kwasem solnym, zdrewniałe błony komórkowe stają się wiśniowoczerwone;
Barwnik Sudan III barwi suberyzowane błony komórkowe na różowo;
słaby roztwór jodu w jodku potasu zabarwia ziarna skrobi na niebiesko.”
Podczas przeprowadzania badań mikroskopowych większość tkanek utrwala się przed barwieniem.
Po utrwaleniu komórki stają się przepuszczalne dla barwników, a struktura komórek zostaje ustabilizowana. Jednym z najpowszechniejszych utrwalaczy w botanice jest alkohol etylowy.
Podczas przygotowania preparatu do mikrokopii wykonuje się cienkie skrawki na mikrotomie (załącznik nr 1, ryc. 1). To urządzenie wykorzystuje zasadę krajalnicy do chleba. W przypadku tkanek roślinnych wykonuje się nieco grubsze skrawki niż w przypadku tkanek zwierzęcych, ponieważ komórki roślinne są stosunkowo większe. Grubość skrawków tkanki roślinnej dla - 10 mikronów - 20 mikronów. Niektóre tkanki są zbyt miękkie, aby można je było od razu przyciąć. Dlatego po utrwaleniu wlewa się je do roztopionej parafiny lub specjalnej żywicy, która nasyca całą tkaninę. Po ochłodzeniu tworzy się stały blok, który następnie jest cięty za pomocą mikrotomu. Wyjaśnia to fakt, że komórki roślinne mają mocne ściany komórkowe, które tworzą szkielet tkanki. Zdrewniałe muszle są szczególnie mocne.
W przypadku użycia farszu w trakcie przygotowania istnieje ryzyko uszkodzenia struktury komórek, aby temu zapobiec, należy zastosować metodę szybkiego zamrażania. Korzystając z tej metody, można obejść się bez mocowania i wypełniania. Zamrożoną tkankę rozcina się za pomocą specjalnego mikrotomu – kriotomu (Załącznik 1, Ryc. 2).
Zamrożone sekcje lepiej zachowują naturalne cechy konstrukcyjne. Są jednak trudniejsze do ugotowania, a obecność kryształków lodu psuje niektóre detale.
mikroskopy fazowo-kontrastowe (załącznik 1, ryc. 3) i mikroskopy interferencyjne (załącznik 1, ryc. 4) umożliwiają badanie żywych komórek pod mikroskopem z wyraźnym ukazaniem szczegółów ich struktury. Mikroskopy te wykorzystują 2 wiązki fal świetlnych, które oddziałują (nakładają się) na siebie, zwiększając lub zmniejszając amplitudę fal docierających do oka z różnych elementów komórki.
Mikroskopia świetlna ma kilka odmian.
Metoda jasnego pola i jej odmiany
Metoda transmitowanego pola świetlnego stosowany w badaniu preparatów przezroczystych zawierających cząsteczki i detale pochłaniające światło (cienkie kolorowe skrawki tkanek zwierzęcych i roślinnych, cienkie skrawki minerałów). W przypadku braku leku wiązka światła z kondensatora przechodząca przez soczewkę wytwarza równomiernie oświetlone pole w pobliżu płaszczyzny ogniskowej okularu. Jeżeli w preparacie znajduje się element pochłaniający, następuje częściowa absorpcja i częściowe rozproszenie padającego na niego światła, co powoduje pojawienie się obrazu. Metodę tę można także zastosować przy obserwacji obiektów nieabsorbujących, ale tylko wtedy, gdy rozpraszają one wiązkę oświetlającą na tyle mocno, że znaczna jej część nie wpada do obiektywu.
Metoda oświetlenia ukośnego- odmiana poprzedniej metody. Różnica między nimi polega na tym, że światło jest kierowane na obiekt pod dużym kątem do kierunku obserwacji. Czasami pomaga to odsłonić „relief” obiektu spowodowany powstawaniem cieni.
Metoda jasnego pola w świetle odbitym używany podczas badania nieprzezroczystych obiektów odbijających światło, takich jak cienkie przekroje metali lub rud. Preparat oświetlany jest (z oświetlacza i półprzezroczystego lusterka) od góry, poprzez soczewkę, która jednocześnie pełni rolę kondensora. W obrazie tworzonym w płaszczyźnie przez soczewkę wraz z soczewką tubusową widoczna jest struktura preparatu ze względu na różnicę współczynnika odbicia jego elementów; W jasnym polu wyróżniają się także niejednorodności rozpraszające padające na nie światło.
Metoda ciemnego pola i jej odmiany
Metoda światła przechodzącego i ciemnego pola służy do uzyskiwania obrazów przezroczystych, niechłonnych obiektów, których nie można zobaczyć metodą jasnego pola. Często są to obiekty biologiczne. Światło z oświetlacza i lusterka kierowane jest na preparat poprzez specjalnie zaprojektowany kondensor – tzw. kondensator ciemnego pola. Po wyjściu z kondensatora główna część promieni świetlnych, która nie zmieniła kierunku po przejściu przez przezroczysty preparat, tworzy wiązkę w postaci wydrążonego stożka i nie wchodzi do soczewki (która znajduje się wewnątrz tego stożka) . Obraz w mikroskopie powstaje przy wykorzystaniu jedynie niewielkiej części promieni rozproszonych przez mikrocząstki leku znajdujące się na szkiełku w stożku i przechodzące przez soczewkę. W polu widzenia na ciemnym tle widoczne są jasne obrazy elementów strukturalnych leku, które różnią się od otaczającego środowiska współczynnikiem załamania światła. Duże cząstki mają tylko jasne krawędzie, które rozpraszają promienie świetlne. Stosując tę metodę, na podstawie wyglądu obrazu nie można określić, czy cząstki są przezroczyste, czy nieprzezroczyste, ani czy mają wyższy, czy niższy współczynnik załamania światła w porównaniu do otaczającego ośrodka.
Mikroskopia elektronowa
Pierwszy mikroskop elektronowy skonstruowali w 1931 roku Knoll i Ruska w Niemczech. Dopiero w latach 50. opracowano metody wytwarzania kształtowników o niezbędnych właściwościach.
Trudność mikroskopii elektronowej polega na tym, że do badania próbek biologicznych konieczne jest specjalne przetwarzanie preparatów.
Pierwszą trudnością jest to, że elektrony mają bardzo ograniczoną zdolność penetracji, dlatego należy przygotować ultracienkie skrawki o grubości 50–100 nm. Aby uzyskać tak cienkie skrawki, tkankę najpierw impregnuje się żywicą: żywica polimeryzuje, tworząc twardy blok z tworzywa sztucznego. Następnie za pomocą ostrego noża szklanego lub diamentowego skrawki wycina się na specjalnym mikrotomie.
Jest jeszcze jedna trudność: kiedy elektrony przechodzą przez tkankę biologiczną, nie uzyskuje się obrazu kontrastowego. W celu uzyskania kontrastu cienkie skrawki próbek biologicznych impregnuje się solami metali ciężkich.
Istnieją dwa główne typy mikroskopów elektronowych. W mikroskopie transmisyjnym wiązka elektronów przechodząca przez specjalnie przygotowaną próbkę pozostawia swój obraz na ekranie. Rozdzielczość współczesnego transmisyjnego mikroskopu elektronowego jest prawie 400 razy większa niż rozdzielczość światła. Mikroskopy te mają rozdzielczość około 0,5 nm.
Pomimo tak wysokiej rozdzielczości transmisyjne mikroskopy elektronowe mają poważne wady:
musisz pracować ze stałymi materiałami;
obraz na ekranie jest dwuwymiarowy (płaski);
Pod wpływem metali ciężkich niektóre struktury komórkowe ulegają zniszczeniu i modyfikacji.
Trójwymiarowy (objętościowy) obraz uzyskuje się za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (EM). Tutaj wiązka nie przechodzi przez próbkę, ale odbija się od jej powierzchni.
Próbkę do badań utrwala się i suszy, po czym pokrywa cienką warstwą metalu, co nazywa się cieniowaniem (próbka jest cieniowana).
Podczas skanowania EM skupiona wiązka elektronów jest kierowana na próbkę (próbka jest skanowana). W rezultacie metalowa powierzchnia próbki emituje elektrony wtórne o niskiej energii. Są one rejestrowane i przekształcane w obraz na ekranie telewizora. Maksymalna rozdzielczość mikroskopu skaningowego jest niewielka, około 10 nm, ale obraz jest trójwymiarowy.
Rodzaje mikroskopii elektronowej:
Amplitudowa mikroskopia elektronowa- Metody amplitudowej mikroskopii elektronowej można zastosować do przetwarzania obrazów ciał amorficznych i innych (których rozmiary cząstek są mniejsze niż odległość rozdzielana w mikroskopie elektronowym), które rozpraszają elektrony. Na przykład w transmisyjnym mikroskopie elektronowym kontrast obrazu, czyli różnica w jasności obrazu sąsiednich obszarów obiektu, jest w pierwszym przybliżeniu proporcjonalny do różnicy w grubości tych obszarów.
Fazowa mikroskopia elektronowa- Do obliczenia kontrastu obrazów ciał krystalicznych o regularnej strukturze, a także do rozwiązania problemu odwrotnego - obliczenia struktury obiektu na podstawie obserwowanego obrazu - stosuje się metody fazowej mikroskopii elektronowej. Rozważano problem dyfrakcji fali elektronowej na sieci krystalicznej, którego rozwiązanie dodatkowo uwzględnia nieelastyczne oddziaływania elektronów z obiektem: rozpraszanie przez plazmy, fonony itp. W transmisyjnych mikroskopach elektronowych i transmisji skaningowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą mikroskopów elektronowych uzyskuje się obrazy poszczególnych cząsteczek lub atomów ciężkich pierwiastków. Za pomocą metod fazowej mikroskopii elektronowej możliwa jest rekonstrukcja trójwymiarowej struktury kryształów i makrocząsteczek biologicznych na podstawie obrazów.
Ilościowa mikroskopia elektronowa- Ilościowe metody mikroskopii elektronowej polegają na precyzyjnym pomiarze różnych parametrów badanej próbki lub procesu, na przykład pomiaru lokalnych potencjałów elektrycznych, pól magnetycznych, mikrogeometrii reliefu powierzchni itp.
Mikroskopia elektronowa Lorentza- Dziedziną badań mikroskopii elektronowej Lorentza, w której bada się zjawiska wywołane siłą Lorentza, są wewnętrzne pola magnetyczne i elektryczne lub zewnętrzne pola błądzące, np. pola domen magnetycznych w cienkich warstwach, domeny ferroelektryczne, pola głów do magnetycznego zapisu informacji itp.
Mikroskopia polaryzacyjna
Mikroskopia polaryzacyjna to metoda obserwacji w świetle spolaryzowanym służąca do badania mikroskopowego preparatów zawierających elementy optycznie anizotropowe (lub składających się wyłącznie z takich pierwiastków). Należą do nich wiele minerałów, ziarna w cienkich przekrojach stopów, niektóre tkanki zwierzęce i roślinne itp. Obserwację można prowadzić zarówno w świetle przechodzącym, jak i odbitym. Światło emitowane przez oświetlacz przechodzi przez polaryzator. Nadana mu polaryzacja zmienia się wraz z późniejszym przejściem światła przez preparat (lub odbiciem od niego). Zmiany te bada się za pomocą analizatora i różnych kompensatorów optycznych. Analizując takie zmiany, można ocenić główne właściwości optyczne mikroobiektów anizotropowych: siłę dwójłomności, liczbę osi optycznych i ich orientację, rotację płaszczyzny polaryzacji i dichroizm.
Metoda kontrastu fazowego
metoda kontrast fazowy i jego odmiana – tzw. metoda kontrast „anoptralny”. przeznaczone są do uzyskiwania obrazów obiektów przezroczystych i bezbarwnych, niewidocznych przy obserwacji metodą jasnego pola. Należą do nich na przykład żywe, niebarwione tkanki zwierzęce. Istota metody polega na tym, że nawet przy bardzo małych różnicach współczynników załamania światła poszczególnych elementów preparatu, przechodząca przez nie fala świetlna ulega różnym zmianom fazowym (uzyskuje tzw. relief fazowy). Niewidoczne bezpośrednio ani dla oka, ani dla kliszy fotograficznej, te zmiany fazowe przekształcają się za pomocą specjalnego urządzenia optycznego w zmiany amplitudy fali świetlnej, czyli w zmiany jasności („ulga amplitudy”), które są już widoczne gołym okiem lub zapisane na warstwie światłoczułej. Innymi słowy, w powstałym widzialnym obrazie rozkład jasności (amplitudy) odtwarza relief fazowy. Uzyskany w ten sposób obraz nazywa się kontrastem fazowym.
Typowy schemat działania metody: w przednim ognisku kondensora zainstalowana jest przysłona aperturowa, której otwór ma kształt pierścienia. Jego obraz pojawia się w okolicach tylnego ogniska obiektywu oraz tzw. płytka fazowa, na powierzchni której znajduje się pierścieniowy występ lub pierścieniowy rowek, zwany pierścieniem fazowym. Płytka fazowa nie zawsze jest umieszczona w ognisku obiektywu - często pierścień fazowy nakładany jest bezpośrednio na powierzchnię jednej z soczewek obiektywu.
W każdym razie promienie z oświetlacza, które nie są załamane w preparacie, dając obraz przesłony, muszą całkowicie przejść przez pierścień fazowy, co znacznie je osłabia (staje się absorbujące) i zmienia ich fazę o l/4 (l to długość fali światła). A promienie, nawet nieznacznie odchylone (rozproszone) w preparacie, przechodzą przez płytkę fazową, omijając pierścień fazowy i nie ulegają dodatkowemu przesunięciu fazowemu.
Biorąc pod uwagę przesunięcie fazowe w materiale preparatu, całkowita różnica faz pomiędzy wiązkami odchylonymi i nieodchylonymi jest bliska 0 lub l/2 i w wyniku interferencji światła w płaszczyźnie obrazu preparatu powstają zauważalnie wzmacniają się lub osłabiają nawzajem, dając kontrastowy obraz struktury preparatu. Promienie odbite mają znacznie mniejszą amplitudę w porównaniu do promieni nieodchylonych, dlatego osłabienie wiązki głównej w pierścieniu fazowym, przybliżając do siebie wartości amplitud, prowadzi również do większego kontrastu obrazu.
Metoda umożliwia wyróżnienie małych elementów konstrukcyjnych o wyjątkowo niskim kontraście w metodzie jasnego pola. Przezroczyste cząstki o stosunkowo niewielkich rozmiarach rozpraszają promienie świetlne pod tak małymi kątami, że promienie te przechodzą razem z promieniami nieodbitymi przez pierścień fazowy. W przypadku takich cząstek efekt kontrastu fazowego występuje tylko w pobliżu ich konturów, gdzie występuje silne rozpraszanie.
Metoda obserwacji w podczerwieni
metoda obserwacje w podczerwieni Promienie (IR) wymagają także zamiany obrazu niewidocznego dla oka na widzialny za pomocą fotografii lub przetwornika elektronowo-optycznego. Mikroskopia IR umożliwia badanie wewnętrznej struktury obiektów nieprzezroczystych w świetle widzialnym, takich jak ciemne szkła, niektóre kryształy i minerały itp.
Metoda obserwacji w ultrafiolecie
metoda obserwacje w promieniach ultrafioletowych (UV). umożliwia zwiększenie maksymalnej rozdzielczości mikroskopu. Główną zaletą tej metody jest to, że cząsteczki wielu substancji, przezroczyste w świetle widzialnym, silnie absorbują promieniowanie UV o określonych długościach fal, dzięki czemu są łatwo rozpoznawalne na obrazach UV. Wiele substancji zawartych w komórkach roślinnych i zwierzęcych (zasady purynowe, zasady pirymidynowe, większość witamin, aminokwasy aromatyczne, niektóre lipidy, tyroksyna itp.) ma charakterystyczne widma absorpcyjne w obszarze UV.
Ponieważ promienie ultrafioletowe są niewidoczne dla ludzkiego oka, obrazy w mikroskopii UV rejestruje się albo fotograficznie, albo przy użyciu konwertera elektronowo-optycznego lub ekranu fluorescencyjnego. Lek jest fotografowany w trzech długościach fal widma UV. Każdy z powstałych negatywów jest oświetlany określonym kolorem światła widzialnego (na przykład niebieskim, zielonym i czerwonym) i wszystkie są jednocześnie wyświetlane na jednym ekranie. Rezultatem jest kolorowy obraz obiektu w konwencjonalnych kolorach, zależnych od zdolności absorpcyjnej leku w świetle ultrafioletowym.
Mikrofotografia i mikrokino- jest to akwizycja obrazów na warstwach światłoczułych za pomocą mikroskopu. Metoda ta jest szeroko stosowana w połączeniu ze wszystkimi innymi metodami badań mikroskopowych. W przypadku mikrofotografii i mikrokina wymagana jest pewna przebudowa układu optycznego mikroskopu - odmienna od wizualnej obserwacji ogniskowania okularu względem obrazu podawanego przez obiektyw. Mikrofotografia jest niezbędna przy dokumentowaniu badań, przy badaniu obiektów w promieniach UV i IR niewidocznych dla oka (patrz wyżej), a także obiektów o niskim natężeniu luminescencji. Fotografia mikrofilmowa jest niezastąpiona przy badaniu procesów zachodzących w czasie (życiowa aktywność komórek tkankowych i mikroorganizmów, wzrost kryształów, występowanie prostych reakcji chemicznych itp.).
Metoda kontrastu interferencyjnego
Metoda kontrastu interferencyjnego (mikroskopia interferencyjna) polega na rozszczepieniu każdej wiązki wchodzącej do mikroskopu. Jeden z powstałych promieni kierowany jest przez obserwowaną cząstkę, drugi - obok niej wzdłuż tej samej lub dodatkowej gałęzi optycznej mikroskopu. W części okularowej mikroskopu obie wiązki są ponownie połączone i zakłócają się nawzajem. Kondensator i soczewka są wyposażone w płytki dwójłomne, z których pierwsza dzieli pierwotną wiązkę światła na dwie wiązki, a druga je łączy. Jeden z promieni przechodzących przez obiekt jest opóźniony w fazie (nabywa różnicę ścieżki w porównaniu z drugim promieniem). Wielkość tego opóźnienia mierzona jest za pomocą kompensatora. Metoda ta pozwala na obserwację obiektów przezroczystych i bezbarwnych, ale ich obrazy mogą być również wielokolorowe (kolory interferencyjne). Metoda ta nadaje się do badania żywych tkanek i komórek i w wielu przypadkach jest stosowana w tym celu. Metodę kontrastu interferencyjnego często stosuje się w połączeniu z innymi metodami mikroskopowymi, w szczególności z obserwacją w świetle spolaryzowanym. Jej zastosowanie w połączeniu z mikroskopią ultrafioletową umożliwia m.in. określenie zawartości kwasów nukleinowych w całkowitej suchej masie obiektu.
Metoda badań w świetle luminescencyjnym
metoda badania w świetle luminescencji polega na obserwacji pod mikroskopem zielono-pomarańczowej poświaty mikroobiektów, która pojawia się po oświetleniu ich światłem niebiesko-fioletowym lub niewidzialnymi dla oka promieniami ultrafioletowymi. Do obwodu optycznego mikroskopu wprowadza się dwa filtry światła. Jeden z nich umieszczony jest przed skraplaczem. Przepuszcza promieniowanie ze źródła oświetlacza tylko o tych długościach fal, które wzbudzają luminescencję samego obiektu (luminescencja wewnętrzna) lub specjalnych barwników wprowadzonych do preparatu i pochłoniętych przez jego cząsteczki (luminescencja wtórna). Drugi filtr, montowany za soczewką, przepuszcza do oka obserwatora (lub warstwy światłoczułej) jedynie światło luminescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna wykorzystuje oświetlenie preparatów zarówno od góry (przez soczewkę, która w tym przypadku pełni także funkcję kondensora), jak i od dołu, poprzez zwykły kondensor. Metoda znalazła szerokie zastosowanie w mikrobiologii, wirusologii, histologii, cytologii, przemyśle spożywczym, badaniach gleby, analizie mikrochemicznej i defektoskopii. Tę różnorodność zastosowań tłumaczy się bardzo dużą wrażliwością barwną oka i wysokim kontrastem obrazu samoświecącego obiektu na ciemnym, nieluminescencyjnym tle.
Metoda repliki
Metodę repliki stosuje się do badania struktury geometrycznej powierzchni masywnych ciał. Z powierzchni takiego ciała pobierany jest odcisk w postaci cienkiej warstwy węgla, kolodionu, formwaru itp., powtarzając relief powierzchniowy i badany w transmisyjnym mikroskopie elektronowym. Zwykle pod kątem ślizgowym (małym w stosunku do powierzchni) na replikę natryskiwana jest w próżni warstwa metalu ciężkiego silnie rozpraszającego elektrony, zacieniając wypukłości i zagłębienia geometrycznego reliefu.
Metoda dekoracji
Metoda dekorowania bada nie tylko strukturę geometryczną powierzchni, ale także mikropola powstałe na skutek obecności dyslokacji, nagromadzeń defektów punktowych, stadiów wzrostu ścian krystalicznych, struktury domenowej itp. Według tej metody bardzo cienka warstwa cząstek dekorujących (atomy Au) są najpierw osadzane na powierzchni próbki, Pt itp., cząsteczki półprzewodników lub dielektryków), osadzane głównie w obszarach, w których skupiają się mikropola, a następnie usuwana jest replika z wtrąceniami cząstek dekorujących.
Aby uzyskać frakcje komórkowe, powszechnie stosuje się różne rodzaje wirowania: wirowanie różnicowe, wirowanie strefowe i wirowanie w równowagowym gradiencie gęstości. Teoretyczne i praktyczne zagadnienia związane z wirowaniem zostały kompleksowo omówione w recenzji Sykesa.
Wirowanie różnicowe
W przypadku wirowania różnicowego próbki wiruje się przez pewien czas przy zadanej prędkości, po czym supernatant jest usuwany. Metoda ta jest przydatna do oddzielania cząstek, które znacznie różnią się szybkością sedymentacji. Na przykład wirowanie przez 5-10 minut przy 3000-5000 d prowadzi do sedymentacji nienaruszonych komórek bakteryjnych, podczas gdy większość fragmentów komórek pozostaje w supernatancie. Fragmenty ścian komórkowych i duże struktury błonowe można osadzać przez wirowanie przy 20 000–50 000 § przez 20 minut, podczas gdy małe pęcherzyki błonowe i rybosomy wymagają wirowania przy 200 000 § przez 1 godzinę w celu uzyskania osadu.
Wirowanie strefowe
Wirowanie strefowe jest skuteczną metodą rozdzielania struktur o podobnej gęstości wyporu, ale różniących się kształtem i masą cząstek. Przykłady obejmują rozdzielenie podjednostek rybosomów, różnych klas polisomów i cząsteczek DNA o różnych kształtach. Wirowanie odbywa się albo w rotorach kubełkowych, albo w specjalnie zaprojektowanych rotorach strefowych; Aby zapobiec konwekcji podczas wirowania, w zlewkach rotora kubełkowego lub w komorze strefowej rotora tworzy się słaby gradient (zwykle sacharoza). Próbkę nanosi się w postaci strefy lub wąskiego paska na samą górę kolumny gradientowej. W przypadku cząstek subkomórkowych zazwyczaj stosuje się gradient sacharozy wynoszący 15 do 40% (w/v).
Metoda Lauego
stosowany do monokryształów. Próbkę naświetla się wiązką o widmie ciągłym, przy czym wzajemna orientacja wiązki i kryształu nie ulega zmianie. Rozkład kątowy ugiętego promieniowania ma postać pojedynczych plam dyfrakcyjnych (Lauegram).
Metoda Debye’a-Scherrera
Służy do badania polikryształów i ich mieszanin. Losowa orientacja kryształów w próbce względem padającej wiązki monochromatycznej zamienia ugięte wiązki w rodzinę współosiowych stożków z wiązką padającą na osi. Ich obraz na kliszy fotograficznej (debyegramie) ma postać koncentrycznych pierścieni, których położenie i intensywność pozwala ocenić skład badanej substancji.
Metoda hodowli komórkowej
Niektóre tkanki można podzielić na pojedyncze komórki, dzięki czemu komórki pozostają żywe i często są w stanie się rozmnażać. Fakt ten definitywnie potwierdza ideę komórki jako żywej jednostki. Gąbkę, prymitywny organizm wielokomórkowy, można rozdzielić na komórki poprzez przetarcie jej przez sito. Po pewnym czasie komórki te łączą się ponownie i tworzą gąbkę. Tkanki embrionalne zwierząt można doprowadzić do dysocjacji za pomocą enzymów lub innych środków osłabiających wiązania między komórkami.
Amerykański embriolog R. Garrison (1879-1959) jako pierwszy wykazał, że komórki embrionalne, a nawet niektóre dojrzałe, w odpowiednim środowisku, mogą rosnąć i rozmnażać się poza organizmem. Technikę tę, zwaną hodowlą komórkową, udoskonalił francuski biolog A. Carrel (1873-1959). Komórki roślinne można również hodować w hodowli, ale w porównaniu z komórkami zwierzęcymi tworzą one większe skupiska i są mocniej ze sobą połączone, dlatego w miarę wzrostu kultury tworzą się tkanki, a nie pojedyncze komórki. W hodowli komórkowej z pojedynczej komórki można wyhodować całą dorosłą roślinę, np. marchewkę.
Metoda mikrofigurowa
Za pomocą mikromanipulatora można usunąć, dodać lub w jakiś sposób zmodyfikować poszczególne części komórki. Dużą komórkę ameby można podzielić na trzy główne elementy – błonę komórkową, cytoplazmę i jądro, a następnie elementy te można ponownie złożyć, tworząc żywą komórkę. W ten sposób można uzyskać sztuczne komórki składające się ze składników różnych typów ameb.
Jeśli weźmiemy pod uwagę, że sztuczna synteza niektórych składników komórkowych wydaje się możliwa, to eksperymenty ze składaniem sztucznych komórek mogą być pierwszym krokiem w kierunku stworzenia nowych form życia w laboratorium. Ponieważ każdy organizm rozwija się z pojedynczej komórki, metoda wytwarzania sztucznych komórek w zasadzie pozwala na konstruowanie organizmów danego typu, jeśli jednocześnie użyje się komponentów nieco różniących się od tych, które znajdują się w istniejących komórkach. W rzeczywistości jednak nie jest wymagana pełna synteza wszystkich składników komórkowych. Strukturę większości, jeśli nie wszystkich, składników komórki określają kwasy nukleinowe. Zatem problem powstawania nowych organizmów sprowadza się do syntezy nowych typów kwasów nukleinowych i zastąpienia ich naturalnymi kwasami nukleinowymi w określonych komórkach.
Metoda fuzji komórek
Inny rodzaj sztucznych komórek można otrzymać poprzez fuzję komórek tego samego lub różnych gatunków. Aby osiągnąć fuzję, komórki poddaje się działaniu enzymów wirusowych; w tym przypadku zewnętrzne powierzchnie dwóch komórek są sklejane ze sobą, a błona między nimi ulega zniszczeniu i powstaje komórka, w której dwa zestawy chromosomów są zamknięte w jednym jądrze. Możliwe jest łączenie komórek różnych typów lub znajdujących się na różnych etapach podziału. Metodą tą udało się uzyskać komórki hybrydowe myszy i kurczaka, człowieka i myszy oraz człowieka i ropuchy. Komórki takie tylko początkowo są hybrydowe, a po licznych podziałach komórkowych tracą większość chromosomów jednego lub drugiego typu. Produktem końcowym staje się na przykład zasadniczo komórka myszy, która nie zawiera żadnych ludzkich genów lub zawiera je tylko w śladowych ilościach. Szczególnie interesująca jest fuzja komórek normalnych i złośliwych. W niektórych przypadkach hybrydy stają się złośliwe, w innych nie, tj. obie właściwości mogą objawiać się zarówno jako dominujące, jak i recesywne. Wynik ten nie jest nieoczekiwany, ponieważ nowotwór złośliwy może być spowodowany różnymi czynnikami i ma złożony mechanizm.
światło mikroskopu komórkowego
Aneks 1
Rycina 2. Kriotom Rysunek 3. Mikroskop z kontrastem fazowym
Rysunek 4. Mikroskop interferencyjny
Opublikowano na Allbest.ru
...Podobne dokumenty
Badanie budowy i zasad działania mikroskopów świetlnych i elektronowych. Uwzględnienie technik ciemnego i jasnego pola, mikroskopii z kontrastem fazowym, interferencji i polaryzacji. Istotne badanie na komórkach stałych. Podstawy mikroskopii elektronowej.
wykład, dodano 16.05.2014
Skaningowy mikroskop tunelowy, zastosowanie. Zasada działania mikroskopu sił atomowych. Badanie obiektów biologicznych – makrocząsteczek (w tym cząsteczek DNA), wirusów i innych struktur biologicznych z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych.
praca na kursie, dodano 28.04.2014
Pojęcie mikroskopii elektronowej jako zespołu metod badania mikrostruktury ciał i ich składu lokalnego za pomocą mikroskopów elektronowych. Treść telewizyjnej zasady skanowania cienkiej wiązki elektronów lub jonów po powierzchni próbki.
prezentacja, dodano 22.08.2015
Pomiar wielkości małych obiektów. Metoda kontrastu fazowego. Pojęcie optyki elektronowej. Stworzenie mikroskopu elektronowego. Eksperymenty z dyfrakcją elektronów. Badanie struktury geometrycznej powierzchni komórek, wirusów i innych mikroobiektów.
prezentacja, dodano 05.12.2017
Metoda badań mikroskopu elektronowego. Fizyczne podstawy skaningowej mikroskopii elektronowej. Schemat skaningowego mikroskopu elektronowego, przeznaczenie jego elementów i ich działanie. Przygotowanie obiektów do badań i specjalne wymagania wobec nich.
praca na kursie, dodano 05.04.2011
Zakres widma optycznego. Teoretyczne podstawy optycznych metod NDT. Lekkie wibracje. Klasyfikacja optycznych metod NDT. Dyskretne widmo emisyjne gazów i cieczy. Ciągłe widmo promieniowania wewnętrznego ciał stałych o różnych temperaturach.
streszczenie, dodano 15.01.2009
Ogólna charakterystyka metod pomiaru parametrów kapilar matryc: interferometria holograficzna, optyka Fouriera, mikroskopowa. Analiza porównawcza rozważanych metod, określenie ich głównych zalet i wad.
test, dodano 20.05.2013
Stworzenie mikroskopu sił atomowych, zasada działania, zalety i wady. Metody mikroskopii sił atomowych. Możliwości techniczne mikroskopu sił atomowych. Zastosowanie mikroskopii sił atomowych do opisu odkształceń folii polimerowych.
praca na kursie, dodano 14.11.2012
Historia mikroskopu - urządzenia umożliwiającego uzyskiwanie powiększonych obrazów obiektów niewidocznych gołym okiem. Metody mikroskopii świetlnej. Zasada działania i budowa mikroskopu metalograficznego. Metody mikroskopowego badania metali.
streszczenie, dodano 06.10.2009
Podstawy skaningowej mikroskopii elektronowej. Cechy metodologiczne badań roztopionych metali pod mikroskopem elektronowym. Cechy mikroskopów przeznaczonych do badania struktury warstw powierzchniowych stopionych metali.
E. Mikroskopia ciemnego pola.
18. Mikroskop składa się z części optycznych i mechanicznych. Co to są części optyczne?
A. Tubus, okular, kondensor
B. Rewolwer, makro- i mikrośruba, lustro
C. Rewolwer, okular
D. Okular, kondensor, obiektyw
E. Tubus, okular, rewolwer
19. Podczas stosowania promieni ultrafioletowych jako źródła światła zwiększa się rozdzielczość mikroskopu. Które urządzenia mikroskopowe korzystają z tego źródła światła?
A. Ciemne pole i luminescencyjne
B. Luminescencyjny, ultrafioletowy
S. Lekki i elektroniczny
D. Kontrast fazowy, ultrafiolet
E. Polaryzacyjne, ultrafioletowe
20. Mikroskop składa się z części mechanicznych i optycznych. Które części mikroskopu mają przesłonę?
A. Okular i obiektyw
B. Okular i kondensor
C. Tubus i okular
D. Soczewka i kondensor
E. Tubus, soczewka, okular
21. W eksperymencie wykorzystano żywe obiekty, w których konieczne było określenie szeregu składników chemicznych za pomocą obserwacji życiowej. Jaka metoda badania mikroskopowego zostanie zastosowana?
A. Mikroskopia z kontrastem fazowym
B. Mikroskopia elektronowa
C. Mikroskopia fluorescencyjna
E Mikroskopia w ciemnym polu.
22. Do badania histologicznego komórek używano luminoforów. Jakiego rodzaju mikroskopii użyto w tym przypadku?
A. Mikroskopia świetlna
B. Mikroskopia elektronowa
C. Mikroskopia fluorescencyjna
D. Mikroskopia polaryzacyjna
E. Mikroskopia ciemnego pola.
23. Zadaniem badacza jest uzyskanie przestrzennego zrozumienia struktury badanego obiektu. Z jakim instrumentem mikroskopowym będzie pracował specjalista?
A. Mikroskopia ultrafioletowa,
B. Mikroskopia z kontrastem fazowym,
C. Transmisyjna mikroskopia elektronowa,
D. Skaningowa mikroskopia elektronowa,
E. Mikroskopia polaryzacyjna
24. Jako źródło światła stosuje się lampy rtęciowo-kwarcowe. Jaka jest rozdzielczość mikroskopu z tym źródłem światła?
25. Rozdzielczość mikroskopu zależy od długości fali źródła światła. Jaka jest zdolność rozdzielcza mikroskopu świetlnego?
26. Przed przystąpieniem do badania preparatu histologicznego należy równomiernie oświetlić pole widzenia. Jakie części mikroskopu służą do tego?
A. Mikro- i makrowit
B. Skraplacz i lustro
C. Rurka i uchwyt probówki
D. Tubus i okular
27. Badaczowi powierzono zadanie zbadania ultramikroskopowej struktury plazmalemy erytrocytów. Jaki instrument mikroskopowy zostanie użyty?
A. Swietowa
B. Kontrast fazowy
C. Elektroniczny
D. Polaryzacja
E. Ultrafiolet
28. Badając tkankę mięśni szkieletowych, konieczne jest określenie izo- i anizotropowej struktury tkanki. Jaki rodzaj mikroskopii zostanie zastosowany?
A. Swietowa
B. Kontrast fazowy
C. Elektroniczny
D. Polaryzacja
E. Ultramikroskopowy
29. Rozdzielczość mikroskopu fluorescencyjnego zależy od długości fali źródła światła. Czemu to jest równe?
A. 0,1 µm C. 0,4 µm
B. 0,2 µm D. 0,1 nm
30. W laboratorium klinicznym badania mikroskopowe służą do badania pełnej morfologii krwi. Jaki mikroskop jest do tego potrzebny?
A. Światowoj,
B. Kontrast fazowy,
S. Elektroniczny,
D. Polaryzacja,
E. Ultrafiolet.
31. Do badań zostaje przedstawiony żywy obiekt wykazujący naturalną luminescencję. Jakiego rodzaju mikroskopii należy użyć do tego badania?
A. Swietowa
B. Kontrast fazowy
C. Elektroniczny
D. Polaryzacja
E. Ultrafiolet
32. W wyniku biopsji uzyskano materiał komórek nowotworowych. Konieczne jest zbadanie ich ultramikroskopowej struktury. Jaki rodzaj mikroskopii zastosowano w tym badaniu?
A. Swietowa
B. Kontrast fazowy
C. Elektroniczny
D. Polaryzacja
E. Ultrafiolet
TEMAT 2: TECHNIKA HISTOLOGICZNA
Podstawowe zasady przygotowania preparatów do mikroskopii świetlnej i elektronowej, pobierania materiału (biopsja, biopsja nakłuciowa, sekcja zwłok). Utrwalanie, odwadnianie, zagęszczanie obiektów, przygotowywanie skrawków na mikrotomach i ultramikrotomach. Rodzaje mikropreparatów - skrawki, rozmazy, odciski, błony, cienkie skrawki. Preparaty barwiące i kontrastujące. Pojęcie barwników histologicznych.
Technika mikroskopowa.
Główne etapy analizy cytologicznej i histologicznej:
Wybór obiektu badawczego
Przygotowanie go do badania pod mikroskopem
Zastosowanie metod mikroskopowych
Analiza jakościowa i ilościowa uzyskanych obrazów
Metody stosowane w technologii histologicznej:
1. Całe życie.
2. Pośmiertnie.
I METODY INTERWITUALNE
Celem badań przyżyciowych jest uzyskanie informacji o życiu komórki: ruchu, podziale, wzroście, różnicowaniu, interakcjach komórkowych, oczekiwanej długości życia, destrukcji, zmianach reaktywnych pod wpływem różnych czynników.
Badanie żywych komórek i tkanek możliwe jest na zewnątrz organizmu (in vitro) lub wewnątrz organizmu (in vivo).
A. Badanie żywych komórek i tkanek w hodowli (in vitro) –
Metoda uprawy
Wyróżnia się: a) hodowle zawiesinowe (komórki zawieszone w pożywce), b) tkankowe, c) narządowe, d) jednowarstwowe.
Najbardziej powszechna jest metoda hodowli tkanki poza organizmem. Tkankę można hodować w specjalnych przezroczystych, hermetycznie zamkniętych komorach. W sterylnych warunkach do komory wprowadza się kroplę pożywki. Najlepszą pożywką jest osocze krwi, do którego dodaje się ekstrakt zarodkowy (wyciąg z tkanek zarodka zawierający dużą ilość substancji stymulujących wzrost). Umieszcza się tam również kawałek narządu lub tkanki (nie więcej niż 1 mm3), który należy poddać hodowli.
Hodowaną tkankę należy utrzymywać w temperaturze ciała organizmu, którego tkankę pobrano do badań. Ponieważ pożywka szybko staje się bezużyteczna (gromadzą się w niej produkty rozkładu uwalniane przez hodowaną tkankę), należy ją wymieniać co 3-5 dni.
Zastosowanie metody hodowli umożliwiło identyfikację szeregu wzorców różnicowania, złośliwej degeneracji komórek, interakcji komórek między sobą, a także z wirusami i drobnoustrojami. Hodowla tkanek embrionalnych umożliwiła badanie rozwoju kości, chrząstki, skóry itp.
Metoda hodowli ma szczególne znaczenie przy prowadzeniu obserwacji eksperymentalnych komórek i tkanek ludzkich, w szczególności w celu określenia płci, zwyrodnienia złośliwego, chorób dziedzicznych itp.
Wady metody:
1. Główną wadą tej metody jest to, że tkankę lub narząd bada się w izolacji od ciała. Nie doświadczając neurohumoralnego wpływu organizmu, traci ono swoje wrodzone zróżnicowanie.
2. Konieczność częstych przeszczepów (przy długotrwałej uprawie).
3. Identyczny współczynnik załamania światła tkanek.
Powiązana informacja.
Mikroskopia polaryzacyjna- jedna z wysoce skutecznych metod badań morfologicznych, posiadająca szerokie możliwości identyfikacji struktur biologicznych, co w połączeniu z dostępnością i względną prostotą decyduje o jej dużej wartości. Metoda umożliwia badanie nie tylko struktury histologicznej leku, ale także niektórych jego parametrów histochemicznych. W latach 40. i 50. XX w. mikroskopię polaryzacyjną uważano za metodę ultrastrukturalną, ponieważ umożliwiała zobaczenie ultrastrukturalnych zdolności tkanek.
Mikroskopia polaryzacyjna przeznaczona jest do badania właściwości struktur histologicznych, które mają zdolność dwójłomności (anizotropii) - rozszczepienia wiązki światła podczas przejścia przez ośrodek anizotropowy. Fala świetlna w ośrodku anizotropowym rozpada się na dwie fale o wzajemnie prostopadłych płaszczyznach drgań fal elektromagnetycznych. Płaszczyzny te nazywane są płaszczyznami polaryzacji. Światło spolaryzowane różni się od światła zwykłego (niespolaryzowanego) tym, że w tym drugim fale świetlne oscylują w różnych płaszczyznach, natomiast w świetle spolaryzowanym występują tylko w określonej płaszczyźnie.
Aby uzyskać efekt polaryzacji, mikroskop polaryzacyjny wykorzystuje dwa polaroidy. Pierwszy, zwany polaryzatorem, umieszcza się pomiędzy oświetlaczem mikroskopu a preparatem histologicznym, drugi polaroid, umieszczony pomiędzy preparatem histologicznym a okiem badacza, pełni funkcję analizatora. Zarówno polaryzator, jak i analizator są optycznie dokładnie tymi samymi filtrami polaryzacyjnymi, więc można je zamieniać (jeśli pozwala na to konstrukcja mikroskopu). Wcześniej do mikroskopii polaryzacyjnej używano pryzmatów Nicolasa, Arensa lub Thomsona wykonanych z drzewca islandzkiego. Pryzmaty te miały ograniczony kąt załamania światła. Obecnie zamiast nich stosuje się płaskie filtry polaryzacyjne, wytwarzające światło spolaryzowane o szerokim polu widzenia.
W tworzeniu światła spolaryzowanego decydującą rolę odgrywa względne położenie polaryzatora i analizatora względem osi optycznej mikroskopu. Jeżeli są one zorientowane w taki sposób, że oba przepuszczają światło spolaryzowane w tej samej płaszczyźnie, tj. gdy ich płaszczyzny polaryzacji pokrywają się, oba filtry polaryzacyjne są w stanie przepuszczać światło spolaryzowane; pole widzenia mikroskopu jest jasne (ryc. 1a).
Ryż. 1 Próbka ludzkiego płuca w jasnym polu, OlympusCX41, obiektyw 10x
Jeżeli płaszczyzny polaryzacyjne filtrów polaryzacyjnych są wzajemnie prostopadłe (uzyskuje się to poprzez obrót analizatora o 90° wokół osi optycznej mikroskopu), wówczas spolaryzowane światło nie przechodzi i badacz widzi ciemne pole widzenia (ryc. 2).
Kiedy polaryzator zostanie obrócony o 360° podczas obrotu, pole widzenia zostanie dwukrotnie całkowicie przyciemnione i dwukrotnie całkowicie rozjaśnione. W przeszłości stosowano filtry kompensacyjne Bernauera, które wytwarzały czerwonawy odcień w ciemnym polu widzenia ( U-TP530 ). Gdy używane są filtry z czarnym lustrem, przyciemnione pole widzenia nie wydaje się całkowicie ciemne, ale raczej słabo oświetlone.
Ryc. 2 Próbka ludzkiego płuca w świetle spolaryzowanym, obiektyw 10x
W przypadku, gdy przy skrzyżowanym położeniu filtrów polaryzacyjnych (tj. w ortoskopii) na drodze światła spolaryzowanego napotykane są substancje anizotropowe zawarte w preparacie histologicznym, substancje te rozdzielają spolaryzowane światło na dwie wiązki o wzajemnie prostopadłych płaszczyznach drgań światła fale. Przez analizator przechodzą promienie świetlne o płaszczyźnie drgań pokrywającej się z płaszczyzną polaryzacji, a te o płaszczyźnie prostopadłej zostają odcięte, w wyniku czego natężenie strumienia świetlnego wpadającego do oka badacza i docierającego do aparatu wynosi tylko połowę intensywność pierwotnej wiązki światła. W wyniku opisanych procesów substancje anizotropowe znajdujące się pomiędzy dwoma skrzyżowanymi polaryzatorami są widoczne na ciemnym tle w postaci jasnych, świecących obiektów. Jednocześnie struktury izotropowe, które nie mają zdolności dwójłomności, pozostają ciemne.
To również ma wpływ na wybór kamery do mikroskopii polaryzacyjnej. Ponieważ zadaniem jest uchwycenie małych, jasnych sygnałów na ciemnym tle, zwykle kamera do mikroskopii w jasnym polu może nie wystarczyć ze względu na małą czułość kamery i dużą ilość szumu generowanego podczas nagrywania. Do mikroskopii polaryzacyjnej Wymagana jest kamera mikroskopowa o wysokiej czułości i dokładnym odwzorowaniu kolorów. Preferowane jest stosowanie kamer opartych na matrycach CCD (VZ-CC50S), jednakże na obecnym etapie można stosować także budżetowe wersje kamer opartych na matrycach CMOS serii Sony IMX (,).
Tkanki biologiczne zawierają wystarczającą liczbę struktur anizotropowych: elementy aparatu kurczliwego mięśni, amyloid, kwas moczowy, formacje kolagenu, niektóre lipidy, wiele kryształów itp.
Promienie świetlne rozszczepiające się w obiekcie anizotropowym i przechodzące przez analizator charakteryzują się nierównymi prędkościami propagacji fal. W zależności od wielkości tej różnicy (tzw wartość opóźnienia wiązki światła) i ze względu na różnice w absorpcji światła w analizatorze, blask obiektów anizotropowych może być biały lub kolorowy. W tym drugim przypadku mówimy o zjawisku dichroizmu ( podwójna absorpcja I). Podczas badania w polu spolaryzowanym efekty kolorystyczne są wytwarzane na przykład przez wiele kryształów.
Proces dwójłomności można wzmocnić poprzez zastosowanie pewnych barwników, których cząsteczki mają zdolność orientowanego osadzania się na strukturach anizotropowych. Reakcje histochemiczne, w wyniku których powstaje efekt anizotropii, nazywane są reakcjami topooptycznymi (G. Romhanyi). Istnieją dwa rodzaje takich reakcji - addytywny i odwrotny. W przypadku reakcji addytywnych zwiększa się opóźnienie wiązki światła, co nazywa się anizotropią dodatnią, w przypadku reakcji odwrotnych maleje - anizotropia ujemna.
SPRZĘT I WYPOSAŻENIE
Mikroskopię polaryzacyjną przeprowadza się za pomocą specjalnych mikroskopów polaryzacyjnych. Jako przykład możemy wymienić importowane mikroskopy. Większość nowoczesnych mikroskopów optycznych wyposażona jest w akcesoria do mikroskopii polaryzacyjnej.
Do mikroskopii polaryzacyjnej można używać dowolnego mikroskopu świetlnego laboratoryjnego lub badawczego. Wystarczą dwa filtry polaryzacyjne, z których jeden, pełniący funkcję polaryzatora, umieszczony jest pomiędzy źródłem światła a preparatem, a drugi, pełniący rolę analizatora, umieszczony jest pomiędzy preparatem a okiem badacza. Polaryzator można wbudować w kondensator lub umieścić pod nim nad przesłoną polową, a analizator można umieścić w szczelinie rewolweru lub we wkładce pośredniej.
Na ryc. Rysunek 3 przedstawia schematyczny diagram mikroskopu polaryzacyjnego. Oprócz elementów wspólnych dla wszystkich mikroskopów świetlnych, mikroskop polaryzacyjny ma dwa filtry polaryzacyjne (polaryzator, zwykle umieszczony pod kondensorem i analizator umieszczony w okularze), a także kompensator. Analizator musi się obracać, a do określenia stopnia obrotu wymagana jest odpowiednia skala stopniowana.
Mikroskop polaryzacyjny wykorzystuje źródło światła zapewniające dużą gęstość wiązki światła. Jako źródło tego typu zaleca się stosować lampę o mocy 100 W i napięciu 12 V. Do niektórych rodzajów badań wymagane jest światło monochromatyczne. W tym celu stosuje się metalowy filtr przeciwzakłóceniowy, który najlepiej umieścić nad lustrem. Przed polaryzatorem, czyli tzw. matowym szkłem, umieszcza się rozpraszające światło matowe szkło. między nim a źródłem światła, ale w żadnym wypadku za polaryzatorem, ponieważ zakłóci to działanie filtra polaryzacyjnego.
W przeszłości w mikroskopii polaryzacyjnej używano obiektywów achromatycznych bez napięcia wewnętrznego, ale obecnie są one rzadkie. Obecnie w mikroskopach polaryzacyjnych stosuje się wyłącznie obiektywy planarno-achromatyczne, które nie posiadają napięć wewnętrznych. Soczewki apochromatyczne można stosować tylko w przypadkach, gdy podczas mikrofotografii wymagane jest normalne odwzorowanie kolorów.
Mikroskopy polaryzacyjne wyposażone są w stolik obrotowy, którego położenie względem osi optycznej można zmieniać. Kąt obrotu stołu mierzony jest za pomocą skali stopni zaznaczonej na jego obwodzie. Jednym z warunków efektywnego wykorzystania mikroskopii polaryzacyjnej jest staranne ustawienie stolika obrotowego za pomocą śrub centrujących.
Ważnym elementem mikroskopu polaryzacyjnego jest kompensator umieszczony pomiędzy obiektywem a analizatorem, zwykle w tubusie mikroskopu. Kompensator to płyta wykonana ze specjalnych rodzajów gipsu, kwarcu lub miki. Pozwala zmierzyć różnicę w drodze rozdzielonych promieni świetlnych wyrażoną w nanometrach. Działanie kompensatora zapewnia jego zdolność do zmiany różnicy w drodze promieni świetlnych, zmniejszając ją do zera lub zwiększając ją do maksimum. Osiąga się to poprzez obrót kompensatora wokół osi optycznej.
TECHNIKA MIKROSKOPII W ŚWIETLE POLARYZOWANYM
Wygodniej jest przeprowadzić mikroskopię polaryzacyjną w zaciemnionym pomieszczeniu, ponieważ intensywność strumienia świetlnego wpadającego do oka badacza jest zmniejszona 2 razy w porównaniu z pierwotnym. Po włączeniu oświetlacza mikroskopu należy w pierwszej kolejności uzyskać jak najjaśniejsze oświetlenie pola widzenia obracając polaryzator lub analizator. To położenie filtrów polaryzacyjnych odpowiada zbieżności ich płaszczyzn polaryzacji. Lek umieszcza się na scenie i najpierw bada w jasnym polu. Następnie obracając polaryzator (lub analizator) pole widzenia przyciemnia się maksymalnie; to położenie filtra odpowiada prostopadłemu ułożeniu płaszczyzn polaryzacji. Aby ujawnić efekt anizotropii, konieczne jest połączenie płaszczyzny polaryzacji obiektu anizotropowego z płaszczyzną światła spolaryzowanego. Empirycznie osiąga się to poprzez obrót stolika obiektowego wokół osi optycznej. Jeżeli do mikroskopii polaryzacyjnej używany jest mikroskop świetlny, który nie jest wyposażony w stolik obrotowy, wówczas preparat histologiczny należy obracać ręcznie. Jest to dopuszczalne, ale w tym przypadku nie można przeprowadzić niektórych rodzajów mikroskopii polaryzacyjnej, które wymagają oceny ilościowej (określenie znaku dwójłomności, wielkości różnicy w drodze promieni świetlnych).
Jeżeli obiekty anizotropowe w próbce są uporządkowane (np. anizotropowe krążki włókien mięśni poprzecznie prążkowanych), wygodnie jest je badać w ustalonym położeniu stołu, w którym obiekty te dają maksymalną luminescencję na ciemnym tle . Jeśli struktury anizotropowe są rozmieszczone chaotycznie w preparacie (na przykład kryształy), wówczas podczas ich badania należy stale obracać scenę, aby uzyskać blask tej lub innej grupy obiektów.
Aby przeprowadzić bardziej dogłębną analizę i ocenę reakcji topooptycznych, konieczna jest znajomość metodologii wyznaczania względnego znaku dwójłomności, wielkości różnicy drogi promieni oraz wskaźnika (współczynnika) refrakcja.
Znak dwójłomności charakteryzuje stopień i kierunek przemieszczenia ścieżki promieni świetlnych przechodzących przez analizator. To przesunięcie jest spowodowane barwnikami topooptycznymi, a jeśli ma na celu zmniejszenie różnicy w drodze promieni, mówi się o ujemnym znaku dwójłomności ( anizotropia ujemna), jeśli pomaga to zwiększyć różnicę w drodze promieni, wówczas stwierdza się dodatni znak dwójłomności ( dodatnia anizotropia). Jeśli zniknie różnica w drodze promieni, efekt anizotropii wyrównuje się.
Znak dwójłomności wyznacza się za pomocą kompensatora. Procedura jego użycia jest następująca. Badany obiekt umieszcza się w pozycji, w której w ciemnym polu widzenia osiągana jest maksymalna luminescencja struktur anizotropowych. Płytka kompensatora RI obracana jest wokół osi optycznej pod kątem +45° względem płaszczyzny polaryzacji analizatora. Obiekt w zależności od różnicy w drodze promieni świetlnych, która może wynosić od 20 do 200 nm, przybiera barwę niebieską lub żółtą. W pierwszym przypadku znak dwójłomności jest dodatni, w drugim - ujemny. Należy pamiętać, że w przypadku ustawienia kompensatora pod kątem +45° całe tło zaciemnionego pola widzenia ma czerwony odcień.
Można także zastosować kompensator λ/4 (U-TP137). Procedura jego użycia jest taka sama, tylko pole widzenia ma szary odcień, a nie czerwony, a obiekt świeci dodatnim znakiem załamania i jest przyciemniany znakiem ujemnym.
Ilościowe określenie różnicy dróg promieni świetlnych wyrażonej w nanometrach przeprowadza się za pomocą kompensatora Braque'a Köhlera. Aby to zrobić, użyj wzoru:
Γ=Γλ×sinφ
gdzie λ jest stałą zaznaczoną na kompensatorze przez producenta, φ jest kątem obrotu kompensatora względem płaszczyzny polaryzacji analizatora.
Współczynnik załamania światła obiektu anizotropowego wyznacza się poprzez porównanie go (pod mikroskopem) z umieszczonym obok przedmiotem testowym. Obiektami badań są ciecze wzorcowe o znanym współczynniku załamania światła. Obiekt i próbka ustawiane są obok siebie na scenie. Kiedy ich współczynniki załamania światła nie są zgodne, pomiędzy obiektem a próbką widoczna jest jasna linia zwana linią Becka. Podniesienie tubusu mikroskopu względem położenia ogniskowego powoduje przesunięcie linii Becka w stronę ośrodka, co daje wyraźniejszy efekt załamania światła. Kiedy współczynniki załamania obiektu i próbki pokrywają się, linia Becka znika. Zazwyczaj współczynnik załamania światła wyznacza się w świetle monochromatycznym dla linii sodowej widma (przy długości fali 589 nm i temperaturze 20°C). Refrakcję należy wyznaczać dla dwóch wzajemnie prostopadłych płaszczyzn polaryzacji. W tym celu wyjmuje się analizator i rejestruje załamanie obiektu w jego dwóch wzajemnie prostopadłych położeniach. Różnica między obydwoma współczynnikami załamania światła (ng - nk) charakteryzuje siłę załamania światła.
CECHY PRZETWARZANIA MATERIAŁU I PRZYGOTOWANIA PREPARATU
Utrwalanie materiału do mikroskopii polaryzacyjnej w kwaśnej formalinie jest niepożądane, gdyż pigment formalinowy powstający w wyniku oddziaływania hemoglobiny tkankowej z kwaśnym formaldehydem ma właściwości anizotropowe i utrudnia badanie preparatów w świetle spolaryzowanym. G. Scheuner i J. Hutschenreiter (1972) zalecają stosowanie w tym celu 10% obojętnej formaliny, roztworu wapniowo-formolowego Bakera i płynu Carnoya.
Czas utrwalania w 10% obojętnej formalinie wynosi 24 - 72 godziny w temperaturze 4°C, w roztworze wapniowo-formolowym Bakera - 16 - 24 godziny w temperaturze 4°C. Utrwalanie w formolu wapniowym jest szczególnie korzystne przy badaniu związków lipidowo-białkowych. Płyn Carnoy'a szybko nasyca tkaniny. Elementy o grubości 1 - 2 mm można profilować już po 1 godzinie w temperaturze 4°C. Utrwalanie w płynie Carnoya nie nadaje się do badań lipidów. Ponadto stosuje się płyn Zenkera, zwłaszcza impregnowany solami złota i srebra. Po potraktowaniu mieszaniną płynu Zenkera i kwasu octowego czerwone krwinki nabywają zdolność do ulegania dwójłomności.
Podczas badania gęstych tkanek (kości, zębów) pod mikroskopem polaryzacyjnym, oprócz odwapnienia kwasem, wymagana jest dodatkowa obróbka w celu usunięcia włókien kolagenowych. W tym celu skrawki takich tkanek gotuje się przez kilka minut w mieszaninie gliceryny i wodorotlenku potasu (10 ml gliceryny i 2 ziarenka wodorotlenku potasu) aż do całkowitego wybielenia, następnie ostrożnie odsącza się alkalia, skrawki przemywa się wodą i przeniesiono pęsetą na stolik mikroskopu.
Do mikroskopii polaryzacyjnej stosuje się skrawki parafinowe, mrożone i kriostatowe. Niezabarwione, zamrożone skrawki przeznaczone do badania w świetle spolaryzowanym zatapia się w glicerynie. Nieutrwalone skrawki kriostatu nadają się do analizy mikroskopowej polaryzacyjnej bezpośrednio po przygotowaniu. Ze względu na dużą wrażliwość na szkodliwe działanie różnych czynników środowiskowych, nadal zaleca się utrwalanie tych odcinków w 10% obojętnym roztworze formaldehydu lub wapniowo-formolowym.
Na wyniki mikroskopii polaryzacyjnej wpływa grubość skrawków histologicznych. Podczas badania grubych przekrojów tworzone są warunki do nakładania się na siebie różnych struktur anizotropowych. Ponadto przy różnych grubościach plasterków właściwości anizotropowe badanych struktur mogą się zmieniać, dlatego bardzo ważne jest, szczególnie w badaniach porównawczych, zapewnienie stałej grubości plasterka. Zalecana maksymalna grubość skrawków nie powinna przekraczać 10 µm.
Kolejnym obowiązkowym warunkiem jest ostrożne odparafinowanie skrawków, ponieważ nieusunięte pozostałości parafiny dają wyraźny efekt anizotropii, co komplikuje badanie. Parafina szczególnie długo utrzymuje się na czerwonych krwinkach i jądrach komórkowych. W celu całkowitego usunięcia parafiny ze skrawków zaleca się wykonanie następującej obróbki.
- Ksylen 30 min
- Alkohol 100% 5 min
- Mieszanina metanolu i chloroformu (1:1) w temperaturze 50°C przez 24 godziny
- Alkohol 100% 5 min
- Alkohol 70% 10 min Woda
Należy także pamiętać, że skrawki poddawane mikroskopii polaryzacyjnej nie powinny mieć kontaktu z fenolami (np. nie należy ich oczyszczać w ksylenie karbolowym).
Bardziej szczegółowe informacje na temat mikroskopii polaryzacyjnej i stosowania kompensatorów można uzyskać pod linkiem (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Jeżeli mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące mikroskopii polaryzacyjnej, prosimy o kontakt ze Szkołą Mikroskopii.
Spośród całej gamy urządzeń do mikroskopii, mikroskopy polaryzacyjne są najbardziej złożone technicznie. Taka dbałość o konstrukcję urządzenia pod kątem wykonalności wynika z konieczności uzyskania obrazów najwyższej jakości, na co bezpośredni wpływ ma konstrukcja części optycznej i oświetleniowej mikroskopu. Głównym obszarem zastosowania urządzeń polaryzacyjnych do mikroskopii jest badanie minerałów, kryształów, żużli, obiektów anizotropowych, tekstyliów i wyrobów ogniotrwałych, a także innych materiałów charakteryzujących się dwójłomnością. Ta ostatnia zasada służy do tworzenia obrazów w urządzeniach mikroskopowych, w których badana próbka jest naświetlana promieniami polaryzacyjnymi. W tym przypadku właściwości anizotropowe próbek pojawiają się po zmianie kierunku wiązki. W tym celu konstrukcja mikroskopów polaryzacyjnych obejmuje filtry polowe obracające się w różnych płaszczyznach względem siebie: analizator obraca się o 180 stopni, a polaryzator obraca się o 360. Główną cechą urządzeń do mikroskopii w świetle spolaryzowanym jest możliwość prowadzenia ortoskopowego i badania konoskopowe, które nie są dostępne w przypadku większości innych typów mikroskopów.
Badanie próbki pod mikroskopem polaryzacyjnym rozpoczyna się od zainstalowania polaryzatora w części oświetlającej mikroskopu, pod kondensorem, obok przysłony aperturowej. W tym przypadku analizator znajduje się pomiędzy okularem a soczewką - za tą ostatnią na drodze promieni świetlnych. Przy prawidłowym ustawieniu takiego urządzenia do mikroskopii, po przekroczeniu pól filtrów, pole widzialne będzie jednolicie ciemne, tworząc tzw. efekt ekstynkcji. Po zakończeniu ustawień urządzenia badana próbka jest mocowana na scenie i badana. Stoły mikroskopów polaryzacyjnych są centrowane względem osi optycznej i można je obracać o 360 stopni, a w podobnych urządzeniach do celów laboratoryjnych i badawczych posiadają także noniusz. Optyka i układ oświetleniowy mikroskopów polaryzacyjnych charakteryzują się najwyższą jakością i taką precyzją wykonania, która pozwala uzyskać możliwie najczystszy obraz bez zniekształceń. Często zestaw urządzeń do badania próbek w świetle spolaryzowanym zawiera kompensator i soczewkę Bertranda. Pierwsza umożliwia efektywne badanie struktury minerałów, a soczewka pozwala na powiększenie i skupienie pola obserwacji, gdy po obróceniu stolika następują zmiany obrazu. Obecnie na rynku dostępne są trzy główne typy takich urządzeń do mikroskopii - wspomniane już mikroskopy badawcze i laboratoryjne, a także działający mikroskop polaryzacyjny.