Polarizētā mikroskopija. Polarizācijas mikroskopija. Interferences mikroskopija. Luminiscences mikroskopija. Mikroskopijas tehnika. Audu kultūra, mikroķirurģija
![Polarizētā mikroskopija. Polarizācijas mikroskopija. Interferences mikroskopija. Luminiscences mikroskopija. Mikroskopijas tehnika. Audu kultūra, mikroķirurģija](https://i1.wp.com/atm-practica.ru/userfiles/image/shkola/lung1.png)
Polarizācijas mikroskopija ir viena no spēcīgākajām metodēm zāļu struktūras un īpašību morfoloģiskai izpētei. Polarizācijas mikroskopija ļauj pētīt to histoloģisko struktūru īpašības, kuras ir divkāršas.
Lai īstenotu polarizācijas mikroskopijas metodi, jebkuru mikroskopu var modernizēt. Mikroskops ir aprīkots ar diviem polarizācijas filtriem: pirmais ir novietots tieši zem kondensatora, otrs atrodas starp lēcu un pētnieka aci. Pagriežot polarizatoru, redzes lauks tiek aptumšots. Zāles tiek novietotas. Pagrieziet preparātu uz skatuves, līdz parādās spilgti mirdzošas struktūras. Mirdzums parādās brīdī, kad divkāršā objekta ass atrodas 45° leņķī pret polarizācijas plakni.
Iepriekš polarizācijas mikroskopijai tika izmantoti polarizācijas filtri ar lineāro polarizāciju. Jaunā tehnika pārbaudīja iespēju diagnosticēt zāles, izmantojot polarizējošos filtrus ar cirkulāru polarizāciju. Izrādījās, ka attēli, kas iegūti, izmantojot apļveida filtrus, satur daudz vairāk informācijas un ļauj identificēt smalkāku audu un šūnu struktūru.
Polarizētās gaismas pētījumus var veikt sasaldētām vai parafīna sekcijām pēc deparafinēšanas, nekrāsotas un iekrāsotas, iestrādātas dažādās vidēs. Audu blokus vajadzētu sagriezt un orientēt tā, lai interesējošā miokarda slāņa muskuļu šķiedras tiktu nogrieztas gareniski.
Miofibrilām polarizētā gaismā ir raksturīgas šķērseniskas svītras, kas saistītas ar anizotropo (A) un izotropo I disku maiņu. A diskiem ir izteikta pozitīva abpusēja laušana un tie izskatās gaiši polarizētā gaismā (parastā gaismā tie ir tumši), savukārt I diskiem gandrīz pilnībā nav divkāršās laušanas, un polarizētā gaismā tie izskatās tumši (parastā gaismā tie ir gaiši).
Izmantojot polarizācijas mikroskopiju, ir ērti identificēt visuniversālākos miokarda un skeleta muskuļu muskuļu šķiedru bojājumus - kontraktūras bojājumus (pavājināta kardiomiocītu šķērseniskā striācija ir viena no agrīnajām miofibrilu bojājuma pazīmēm).
Ir ierasts izšķirt 3 šo bojājumu stadijas:
I posms - anizotropija palielinās noteiktos muskuļu šķiedru apgabalos. II
posms - A-diski ar paaugstinātu anizotropiju satuvinās, kā rezultātā 1-disku biezums samazinās. III
posms - A-diski saplūst nepārtrauktā anizotropā konglomerātā.
Kopā ar kontraktūras traumām, polarizējošā mikroskopija
ļauj identificēt cita veida šķērssvītroto muskuļu šķiedru bojājumu - sarkomēru hiperrelaksāciju, kas lielā mērā raksturīga miokarda išēmijai.
Polarizācijas metodes vienkāršība ar minimālām izmaksām ļauj ievērojami palielināt miokarda infarkta diagnostikas ticamību.
Par polarizējošo mikroskopu. Situācija ir tāda, ka gandrīz jebkuru mikroskopu var izveidot par polarizējošu mikroskopu. Tiek izmantoti divi polarizējošie filtri (iegādāti foto veikalā) - viens ir novietots virs apgaismotāja, bet otrs atrodas starp preparātu un objektīvu.
Ir izveidots atsauces CD-ROM - “Polarizācijas mikroskopija”. Diskā ir liels skaits darbu un materiālu par polarizācijas mikroskopijas izmantošanu.
Papildus ir izveidots specializēts komplekss - automatizēta tiesu medicīnas darbstacija. Kompleksā ietilpst Nikon E200 polarizējošais mikroskops, digitālā kamera ar 8 miljoniem elementu, adapteri un programmatūra.
Atsauces: 1.
Kakturskis L.V. Polarizācijas mikroskopija. Grāmatā. Mikroskopiskā tehnika. - M.: Medicīna, 1996. 2.
Cellarius Yu.G., Semenova L.A. Polarizācijas mikroskopijas pielietojums miokarda išēmisku un metabolisku bojājumu agrīno stadiju histoloģiskai diagnostikai // Cor et vasa. - 1977. gads. 19. - Nr.1. - P. 28-33 3.
Nepomņaščiha L.M. Sirds svarīgāko vispārējo patoloģisko procesu morfoģenēze. - Novosibirska: Nauka, 1991. - 352 lpp. 4.
Cellarius Yu.G., Semenova L.A., Nepomnyashchikh L.M. Fokālās traumas un miokarda infarkts. Gaisma, polarizācija un elektronu mikroskopija. - Novosibirska, 1980.
Vairāk par tēmu Koltova N.A. JAUNA POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJAS METODE MIOKARDA INFRAKTA DIAGNOZEI:
- 252. JAUTĀJUMS: Kādi medicīnas darbinieku profesionālās darbības trūkumi var kļūt par iemeslu krimināllietas vai civillietas ierosināšanai?
- Kirilovs V.A., Bahmetjevs V.I. MORFOMETRISKĀS METODES IZMANTOŠANA ARĒJĀS IETEKMES TIPA DIAGNOSTIKAS DIAGNOSTIKAI PĒC GARO TUBUULĀLO KAULU IZNĪCINĀŠANAS MORFOLOĢISKĀS PAZĪMES
- Mišins E.S., Podporinova E.E., Pravodelova A.O. HIPOGLOZĀ KAULA, BALSEŅA UN TRAHEJAS BOJĀJUMU DIAGNOSTIKAS METOŽU NOVĒRTĒJUMS STRĀLU KAKLA TRAUMOJUMĀ
POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA
POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA
Fiziskā enciklopēdiskā vārdnīca. - M.: Padomju enciklopēdija. . 1983 .
POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA
-
skatīt Art. Mikroskopija.
Fiziskā enciklopēdija. 5 sējumos. - M.: Padomju enciklopēdija. Galvenais redaktors A. M. Prohorovs. 1988 .
Skatiet, kas ir "POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA" citās vārdnīcās:
POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA- mikroskopija, kuras pamatā ir dažādu šūnu un audu komponentu spēja lauzt polarizētos starus. Polarizējošo mikroskopu var izmantot, lai pārbaudītu objektus, kuriem ir divkāršs lūzums... Botānisko terminu vārdnīca
Metožu (un ierīču, kas nodrošina šīs metodes) kopums, kas paredzēts tādu objektu novērošanai un pētīšanai mikroskopā, kuri jebkurā ziņā maina gaismas polarizāciju (sk. Gaismas polarizācija), kas iet caur objektiem... ...
POLARIZĀCIJAS MIKROSKOPIJA- skat. Mikroskops, Mikroskopiskā tehnika... Veterinārā enciklopēdiskā vārdnīca
Vispārējs nosaukums metodēm, kā mikroskopā novērot objektus, kas cilvēka acij nav atšķirami. Sīkāku informāciju skatiet Art. (skat. MIKROSKOPS). Fiziskā enciklopēdiskā vārdnīca. M.: Padomju enciklopēdija. Galvenais redaktors A. M. Prohorovs. 1983... Fiziskā enciklopēdija
M. apgaismojot objektu ar polarizētu gaismu; izmanto, lai atklātu un pētītu objektus vai to struktūras, kurām ir divkāršas laušanas īpašības... Liela medicīniskā vārdnīca
Termins skenējošās zondes mikroskopija Termins angļu valodā skenējošā zondes mikroskopija Sinonīmi Saīsinājumi SPM, SPM Saistītie termini "gudrie" materiāli, atomu spēka mikroskopija, manipulācija ar atomu, konsoles, mikroskops, ... ... Enciklopēdiskā nanotehnoloģiju vārdnīca
Dažādu objektu izpētes metodes, izmantojot mikroskopu. Bioloģijā un medicīnā šīs metodes ļauj izpētīt mikroskopisku objektu struktūru, kuru izmēri pārsniedz cilvēka acs izšķirtspēju. Pamats M.m.i. sastāda...... Medicīnas enciklopēdija
- (no grieķu valodas ἱστός audi un grieķu λόγος zināšanas, vārds, zinātne) bioloģijas sadaļa, kas pēta dzīvo organismu audu uzbūvi. To parasti veic, sagriežot audus plānos slāņos, izmantojot mikrotomu. Atšķirībā no anatomijas, ... ... Wikipedia
Mikroskops (no micro... un grieķu skopéo I look), optiska ierīce ar neapbruņotu aci neredzamu objektu (vai to struktūras detaļu) ļoti palielinātu attēlu iegūšanai. Cilvēka acs ir dabiska optiskā... Lielā padomju enciklopēdija
I Microscope (no Mikro... un grieķu skopéo I look) ir optiska ierīce ar neapbruņotu aci neredzamu objektu (vai to struktūras detaļu) ļoti palielinātu attēlu iegūšanai. Cilvēka acs ir dabiska... Lielā padomju enciklopēdija
Grāmatas
- Ievads kvantitatīvā citoķīmijā. Šūnu un tam izmantoto optisko iekārtu izpētes kvantitatīvo metožu kopsavilkums. Grāmata koncentrējas uz visdrošākajām metodēm kvantitatīvās noteikšanas...
Polarizācijas mikroskopija- viena no ļoti efektīvām morfoloģiskās izpētes metodēm, kurai ir plašas bioloģisko struktūru identificēšanas iespējas, kas apvienojumā ar pieejamību un relatīvo vienkāršību nosaka tās augsto vērtību. Metode ļauj izpētīt ne tikai zāļu histoloģisko struktūru, bet arī dažus tās histoķīmiskos parametrus. XX gadsimta 40. un 50. gados. polarizācijas mikroskopija tika uzskatīta par ultrastrukturālu metodi, jo tā ļāva redzēt audu ultrastrukturālās spējas.
Polarizācijas mikroskopija ir paredzēta, lai pētītu histoloģisko struktūru īpašības, kurām ir divkāršās laušanas (anizotropijas) spēja - gaismas stara sadalīšana, izejot cauri anizotropai videi. Gaismas vilnis anizotropā vidē sadalās divos viļņos ar savstarpēji perpendikulārām elektromagnētisko viļņu svārstību plaknēm. Šīs plaknes sauc par polarizācijas plaknēm. Polarizētā gaisma atšķiras no parastās (nepolarizētās) gaismas ar to, ka pēdējā gaismas viļņi svārstās dažādās plaknēs, savukārt polarizētajā gaismā tie notiek tikai noteiktā plaknē.
Lai radītu polarizācijas efektu, polarizējošais mikroskops izmanto divus polaroīdus. Pirmais, ko sauc par polarizatoru, ir novietots starp mikroskopa apgaismotāju un histoloģisko paraugu, bet otrs polaroīds, kas atrodas starp histoloģisko paraugu un pētnieka aci, ir analizators. Gan polarizators, gan analizators ir optiski tieši tādi paši polarizācijas filtri, tāpēc tos var nomainīt (ja mikroskopa dizains to atļauj). Iepriekš polarizācijas mikroskopijai tika izmantotas no Islandes špaga izgatavotas Nicolas, Arens vai Thomson prizmas. Šīm prizmām bija ierobežots gaismas laušanas leņķis. Pašlaik to vietā tiek izmantoti plakanie polarizācijas filtri, kas rada plaša lauka polarizētu gaismu.
Polarizētas gaismas veidošanā noteicošā loma ir polarizatora un analizatora relatīvajam novietojumam attiecībā pret mikroskopa optisko asi. Ja tie ir orientēti tā, lai abi polarizēto gaismu raidītu vienā plaknē, t.i. kad to polarizācijas plaknes sakrīt, abi polarizācijas filtri spēj pārraidīt polarizētu gaismu; mikroskopa redzes lauks ir spilgts (1.a att.).
Rīsi. 1 cilvēka plaušu gaišā lauka paraugs, OlympusCX41, 10x objektīvs
Ja polarizācijas filtru polarizācijas plaknes ir savstarpēji perpendikulāras (to panāk, analizatoru pagriežot par 90° ap mikroskopa optisko asi), tad polarizētā gaisma cauri neiziet un pētnieks redz tumšu redzes lauku (att. 2).
Kad polarizators tiek pagriezts par 360°, kad tas griežas, redzes lauks tiek pilnībā aptumšots divreiz un pilnībā izgaismots divreiz. Agrāk tika izmantoti kompensējošie Bernauera filtri, kas tumšajā redzes laukā rada sarkanīgu nokrāsu ( U-TP530 ). Lietojot melnus spoguļu filtrus, aptumšotais skata lauks nešķiet pilnīgi tumšs, bet gan vāji izgaismots.
2. attēls. Cilvēka plaušu paraugs polarizētā gaismā, 10x objektīvs
Gadījumos, kad polarizējošo filtru krustojuma stāvoklī (t.i., ortoskopijā) polarizētās gaismas ceļā tiek sastaptas histoloģiskā paraugā esošās anizotropās vielas, šīs vielas sadala polarizēto gaismu divos staros ar savstarpēji perpendikulārām gaismas svārstību plaknēm. viļņi. Gaismas stari, kuru vibrācijas plakne sakrīt ar polarizācijas plakni, iziet cauri analizatoram, un tie, kuru plakne ir perpendikulāra, tiek nogriezti, kā rezultātā gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī un uz kameru, ir tikai puse. sākotnējā gaismas stara intensitāte. Aprakstīto procesu rezultātā anizotropās vielas, kas atrodas starp diviem krustojošiem polarizatoriem, ir redzamas uz tumša fona gaišu gaismas objektu veidā. Tajā pašā laikā izotropās struktūras, kurām nav divkāršās laušanas spējas, paliek tumšas.
Tas arī ietekmē izvēli polarizācijas mikroskopijas kameras. Tā kā uzdevums ir tvert mazus spilgtus signālus uz tumša fona, parasti ar kameru spilgta lauka mikroskopijai var nepietikt kameras zemās jutības un lielā trokšņa daudzuma dēļ, kas rodas ierakstīšanas laikā. Polarizācijas mikroskopijai Nepieciešama mikroskopijas kamera ar augstu jutību un precīzu krāsu atveidi. Vēlams izmantot kameras, kuru pamatā ir CCD matricas (, VZ-CC50S), tomēr pašreizējā posmā varat izmantot arī kameru budžeta versijas, kuru pamatā ir Sony IMX sērijas CMOS matricas ().
Bioloģiskie audi satur pietiekamu skaitu anizotropu struktūru: muskuļu kontraktilās aparāta elementus, amiloīdu, urīnskābi, kolagēna veidojumus, dažus lipīdus, vairākus kristālus utt.
Gaismas stariem, kas sadalās anizotropā objektā un iet cauri analizatoram, ir raksturīgi nevienlīdzīgi viļņu izplatīšanās ātrumi. Atkarībā no šīs atšķirības lieluma (to sauc arī gaismas stara aizkaves vērtība) un gaismas absorbcijas atšķirību dēļ analizatorā anizotropo objektu mirdzums var būt balts vai krāsains. Pēdējā gadījumā mēs runājam par dihroisma fenomenu ( dubultā absorbcija I). Pētot polarizētā laukā, krāsu efektus rada, piemēram, daudzi kristāli.
Divkāršās laušanas procesu var pastiprināt, izmantojot noteiktas krāsvielas, kuru molekulas spēj orientēti nogulsnēties uz anizotropām struktūrām. Histoķīmiskās reakcijas, kuru rezultātā rodas anizotropijas efekts, sauc par topooptiskām reakcijām (G. Romhani). Ir divu veidu šādas reakcijas – aditīvās un apgrieztās. Ar aditīvām reakcijām palielinās gaismas stara aizkave, ko sauc par pozitīvo anizotropiju, ar apgrieztām reakcijām tā samazinās - negatīva anizotropija.
APARATŪRA UN IEKĀRTAS
Polarizācijas mikroskopija tiek veikta, izmantojot īpašus polarizācijas mikroskopus. Kā piemēru varam nosaukt importētos mikroskopus. Lielākā daļa mūsdienu optisko mikroskopu ir aprīkoti ar piederumiem polarizācijas mikroskopijai.
Polarizācijas mikroskopijai var izmantot jebkuru laboratorijas vai pētniecības klases gaismas mikroskopu. Pietiek ar diviem polarizācijas filtriem, no kuriem viens, kas darbojas kā polarizators, atrodas starp gaismas avotu un paraugu, bet otrs, kas pilda analizatora lomu, atrodas starp paraugu un pētnieka aci. Polarizatoru var iebūvēt kondensatorā vai novietot zem tā virs lauka diafragmas, un analizatoru var ievietot revolvera spraugā vai starpposma ieliktnī.
Attēlā 3. attēlā parādīta polarizējošā mikroskopa shematiska diagramma. Papildus komponentiem, kas ir kopīgi visiem gaismas mikroskopiem, polarizējošajam mikroskopam ir divi polarizācijas filtri (polarizators, kas parasti atrodas zem kondensatora, un analizators, kas atrodas okulārā), kā arī kompensators. Analizatoram ir jāgriežas, un, lai noteiktu rotācijas pakāpi, ir nepieciešama atbilstoša graduēta skala.
Polarizējošais mikroskops izmanto apgaismojuma avotu, kas nodrošina augstu gaismas stara blīvumu. Kā šādu avotu ieteicams izmantot 100 W lampu ar spriegumu 12 V. Dažiem pētījumu veidiem ir nepieciešama monohromatiska gaisma. Šim nolūkam tiek izmantots metāla traucējumu filtrs, kuru vislabāk novietot virs spoguļa. Pirms polarizatora novieto gaismu izkliedējošu matētu stiklu, t.i. starp to un gaismas avotu, bet nekādā gadījumā pēc polarizatora, jo tas izjauks polarizējošā filtra darbību.
Agrāk polarizācijas mikroskopijā izmantoja ahromatiskus objektīvus bez iekšējas spriedzes, taču tagad tie ir reti sastopami. Mūsdienās polarizējošajos mikroskopos tiek izmantoti tikai plāna ahromatiskie objektīvi, kuriem nav iekšējas spriedzes. Apohromatiskās lēcas var izmantot tikai gadījumos, kad mikrofotografēšanas laikā nepieciešama normāla krāsu atveide.
Polarizējošie mikroskopi ir aprīkoti ar rotējošu stadiju, kuras novietojums attiecībā pret optisko asi ir maināms. Galda griešanās leņķi mēra, izmantojot grādu skalu, kas atzīmēta gar tā apkārtmēru. Viens no priekšnoteikumiem efektīvai polarizācijas mikroskopijas izmantošanai ir rūpīga rotējošās pakāpes izlīdzināšana, izmantojot centrēšanas skrūves.
Svarīgs polarizējošā mikroskopa elements ir kompensators, kas atrodas starp objektīvu un analizatoru, parasti mikroskopa caurulē. Kompensators ir plāksne, kas izgatavota no īpaša veida ģipša, kvarca vai vizlas. Tas ļauj izmērīt atšķirību sadalīto gaismas staru ceļā, kas izteikts nanometros. Kompensatora darbību nodrošina tā spēja mainīt gaismas staru ceļa starpību, samazinot to līdz nullei vai palielinot līdz maksimumam. To panāk, pagriežot kompensatoru ap optisko asi.
MIKROSKOPIJAS TEHNIKA POLARIZĒTĀ GAISMĀ
Polarizācijas mikroskopiju ir ērtāk veikt aptumšotā telpā, jo gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī, tiek samazināta 2 reizes, salīdzinot ar sākotnējo. Pēc mikroskopa apgaismotāja ieslēgšanas vispirms panākiet pēc iespējas spilgtāku redzes lauka apgaismojumu, pagriežot polarizatoru vai analizatoru. Šis polarizācijas filtru novietojums atbilst to polarizācijas plakņu sakritībai. Zāles tiek novietotas uz skatuves un vispirms tiek pētītas gaišā laukā. Pēc tam, pagriežot polarizatoru (vai analizatoru), redzes lauks tiek pēc iespējas tumšāks; šī filtra pozīcija atbilst polarizācijas plakņu perpendikulārajam izvietojumam. Lai atklātu anizotropijas efektu, ir nepieciešams apvienot anizotropā objekta polarizācijas plakni ar polarizētās gaismas plakni. Empīriski tas tiek panākts, pagriežot objekta stadiju ap optisko asi. Ja polarizācijas mikroskopijai izmanto gaismas mikroskopu, kas nav aprīkots ar rotējošu stadiju, tad histoloģiskais paraugs ir jāpagriež manuāli. Tas ir pieņemami, taču šajā gadījumā nav iespējams veikt noteikta veida polarizācijas mikroskopiju, kam nepieciešams kvantitatīvs novērtējums (nosakot divkāršās laušanas zīmi, gaismas staru ceļa atšķirības lielumu).
Ja anizotropie objekti testa paraugā ir sakārtoti (piemēram, šķērssvītrotu muskuļu šķiedru anizotropie diski), ir ērti tos pētīt fiksētā skatuves pozīcijā, kurā šie objekti dod maksimālu luminiscenci uz tumša fona. . Ja preparātā haotiski atrodas anizotropās struktūras (piemēram, kristāli), tad tos pētot ir nepārtraukti jāgroza skatuve, lai panāktu vienas vai otras objektu grupas mirdzumu.
Lai veiktu padziļinātu topooptisko reakciju analīzi un novērtēšanu, ir jāzina divkāršās laušanas relatīvās zīmes, staru ceļa starpības lieluma un starojuma indeksa (koeficienta) noteikšanas metodika. refrakcija.
Divkāršās laušanas zīme raksturo caur analizatoru ejošo gaismas staru ceļa pārvietošanās pakāpi un virzienu. Šo nobīdi izraisa topooptiskās krāsvielas, un, ja tā ir vērsta uz staru ceļa atšķirības samazināšanu, tās runā par negatīvu divkāršās laušanas pazīmi ( negatīva anizotropija), ja tas palīdz palielināt staru ceļa atšķirību, tad tiek konstatēta pozitīva dubultlaušanas pazīme ( pozitīva anizotropija). Ja staru ceļa atšķirība pazūd, tad anizotropijas efekts tiek izlīdzināts.
Divkāršās laušanas zīmi nosaka, izmantojot kompensatoru. Tās lietošanas procedūra ir šāda. Pētāmais objekts ir novietots tādā stāvoklī, kurā tiek sasniegta maksimālā anizotropo struktūru luminiscence tumšā redzes laukā. RI kompensatora plāksne tiek pagriezta ap optisko asi +45° leņķī attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni. Objekts, atkarībā no gaismas staru ceļa atšķirības, kas var svārstīties no 20 līdz 200 nm, iegūst vai nu zilu vai dzeltenu krāsu. Pirmajā gadījumā divkāršās lūzuma pazīme ir pozitīva, otrajā - negatīva. Jāpatur prātā, ka gadījumā, ja kompensators atrodas +45° leņķī, kopējais aptumšotā redzes lauka fons ir sarkanā nokrāsa.
Var izmantot arī λ/4 kompensatoru (U-TP137). Tā lietošanas procedūra ir tāda pati, tikai redzes laukam ir pelēks nokrāsa, nevis sarkans, un objekts spīd ar pozitīvu refrakcijas zīmi un ir aptumšots ar negatīvu zīmi.
Gaismas staru ceļa atšķirības kvantitatīvā noteikšana, kas izteikta nanometros, tiek veikta, izmantojot Braque Köhler kompensatoru. Lai to izdarītu, izmantojiet formulu:
Γ=Γλ×sinφ
kur λ ir konstante, ko ražotājs atzīmējis uz kompensatora, φ ir kompensatora griešanās leņķis attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni.
Anizotropa objekta refrakcijas indeksu nosaka, salīdzinot to (zem mikroskopa) ar blakus novietotu testa objektu. Kā testa objekti tiek izmantoti standarta šķidrumi ar zināmu refrakcijas koeficientu. Priekšmets un paraugs uz skatuves novietoti blakus. Ja to refrakcijas rādītāji nesakrīt, starp objektu un paraugu ir redzama gaiša līnija, ko sauc par Beka līniju. Mikroskopa caurules pacelšana attiecībā pret fokusēto pozīciju izraisa Beka līnijas nobīdi pret vidi, kas dod izteiktāku refrakcijas efektu. Kad objekta un parauga refrakcijas rādītāji sakrīt, Beka līnija pazūd. Parasti refrakcijas indeksu nosaka monohromatiskā gaismā spektra nātrija līnijai (pie viļņa garuma 589 nm un temperatūrā 20 ° C). Refrakcija jānosaka divām savstarpēji perpendikulārām polarizācijas plaknēm. Šim nolūkam analizators tiek noņemts un objekta refrakcija tiek reģistrēta abās savstarpēji perpendikulārajās pozīcijās. Atšķirība starp abiem refrakcijas rādītājiem (ng - nk) raksturo laušanas spēku.
MATERIĀLU APSTRĀDES UN PREPARĀTU SAGATAVOŠANAS ĪPAŠĪBAS
Fiksācijas materiāls polarizācijas mikroskopijai skābā formalīnā nav vēlams, jo formalīna pigmentam, kas veidojas audu hemoglobīna mijiedarbībā ar skābo formaldehīdu, ir anizotropas īpašības un tas apgrūtina preparātu izpēti polarizētā gaismā. G. Scheuner un J. Hutschenreiter (1972) iesaka šim nolūkam izmantot 10% neitrālu formalīnu, Beikera kalcija-formola šķīdumu un Carnoy šķidrumu.
Fiksācijas ilgums 10% neitrālā formalīnā 4 °C temperatūrā ir 24 - 72 stundas, Beikera kalcija-formola šķīdumā - 16 - 24 stundas 4 °C temperatūrā. Fiksācija kalcija-formolā ir īpaši ieteicama, pētot lipīdu-olbaltumvielu savienojumus. Carnoy šķidrums ātri piesātina audumus. Gabalus ar biezumu 1 - 2 mm var profilēt jau pēc 1 stundas 4 °C temperatūrā. Fiksācija Carnoy šķidrumā nav piemērota lipīdu pētījumiem. Turklāt tiek izmantots Zenker šķidrums, it īpaši, ja tas ir piesūcināts ar zelta un sudraba sāļiem. Pēc apstrādes ar Zenkera šķidruma un etiķskābes maisījumu sarkanās asins šūnas iegūst spēju veikt divkāršu lūzumu.
Pārbaudot blīvos audus (kaulus, zobus) polarizējošā mikroskopā, papildus skābes atkaļķošanai ir nepieciešama papildu apstrāde kolagēna šķiedru noņemšanai. Šim nolūkam šādu audu sekcijas vairākas minūtes vāra glicerīna un kālija hidroksīda maisījumā (10 ml glicerīna un 2 graudi kālija hidroksīda), līdz tās pilnībā izbalē, pēc tam rūpīgi notecina sārmu, sekciju mazgā ūdenī. un ar pinceti pārnes uz mikroskopa stadiju.
Polarizācijas mikroskopijai izmanto parafīna, saldētās un kriostata sekcijas. Nekrāsotas saldētas sekcijas pārbaudei polarizētā gaismā ir iestrādātas glicerīnā. Nefiksētas kriostata sekcijas ir piemērotas polarizācijas mikroskopiskai analīzei tūlīt pēc sagatavošanas. Tā kā šīs sekcijas ir ļoti jutīgas pret dažādu vides faktoru kaitīgo ietekmi, tās joprojām ir ieteicams nostiprināt 10% neitrālā formaldehīda vai kalcija-formola šķīdumā.
Polarizācijas mikroskopijas rezultātus ietekmē histoloģisko griezumu biezums. Pētot biezus posmus, tiek radīti apstākļi dažādu anizotropu struktūru superpozīcijai viena virs otras. Turklāt ar dažādu slāņu biezumu var mainīties pētāmo konstrukciju anizotropās īpašības, tāpēc ir ļoti svarīgi, īpaši salīdzinošajos pētījumos, nodrošināt nemainīgu šķēles biezumu. Ieteicamais maksimālais sekcijas biezums nedrīkst pārsniegt 10 µm.
Vēl viens obligāts nosacījums ir rūpīga sekciju atvaskošana, jo nenoņemtie parafīna atlikumi rada izteiktu anizotropijas efektu, apgrūtinot pētījumu. Parafīns īpaši ilgi saglabājas uz sarkanajām asins šūnām un šūnu kodoliem. Lai pilnībā noņemtu parafīnu no sekcijām, ieteicams veikt šādu apstrādi.
- Ksilols 30 min
- Alkohols 100% 5 min
- Metanola un hloroforma maisījums (1:1) 50 °C temperatūrā 24 stundas
- Alkohols 100% 5 min
- Alkohols 70% 10 min Ūdens
Jāpatur prātā arī tas, ka sekcijas, kas pakļautas polarizācijas mikroskopijai, nedrīkst nonākt saskarē ar fenoliem (piemēram, tās nedrīkst attīrīt karboliskajā ksilolā).
Sīkāku informāciju par polarizācijas mikroskopiju un kompensatoru izmantošanu var iegūt saitē (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Ja jums ir kādi jautājumi par polarizācijas mikroskopiju, lūdzu, sazinieties ar Mikroskopijas skolu.
Fāzes kontrasta mikroskopijas metode
Lielākā daļa šūnu struktūru maz atšķiras pēc gaismas refrakcijas indeksa un staru absorbcijas viena no otras un vides. Lai pētītu šādas sastāvdaļas, ir jāmaina apgaismojums (ar attēla skaidrības zudumu) vai jāizmanto īpašas metodes un instrumenti. Fāzes kontrasta mikroskopijas metode ir viena no tām. To plaši izmanto šūnu dzīvībai svarīgos pētījumos. Metodes būtība ir tāda, ka pat ar ļoti nelielām dažādu preparāta elementu refrakcijas koeficientu atšķirībām gaismas vilnis, kas iet caur tiem, piedzīvo dažādas fāzes izmaiņas. Šīs fāzes izmaiņas, kas ir neredzamas tieši acij vai fotoplatei, ar speciālas optiskās ierīces palīdzību tiek pārveidotas gaismas viļņa amplitūdas izmaiņās, t.i., spilgtuma izmaiņās, kas jau ir redzamas acij vai ierakstītas gaismjutīgā ierīcē. slānis. Iegūtajā redzamajā attēlā spilgtuma (amplitūdas) sadalījums atveido fāzes reljefu. Šādā veidā iegūto attēlu sauc par fāzes kontrastu. Objekti var izskatīties tumši uz gaiša fona (pozitīvs fāzes kontrasts) vai gaiši uz tumša fona (negatīvs fāzes kontrasts).
Interferences kontrasta metode (interferences mikroskopija)
Interferences kontrasta metode ir līdzīga iepriekšējai - tās abas ir balstītas uz staru traucējumiem, kas iet cauri mikrodaļiņai un iet tai garām. Paralēlu gaismas staru kūlis no apgaismotāja, nonākot mikroskopā, sadalās divās plūsmās. Viens no iegūtajiem stariem tiek virzīts caur novēroto daļiņu un iegūst izmaiņas svārstību fāzē, otrs - apejot objektu pa to pašu vai papildu mikroskopa optisko atzaru. Mikroskopa okulāra daļā abi stari atkal ir savienoti un traucē viens otru. Interferences rezultātā tiks uzbūvēts attēls, kurā šūnas apgabali ar dažādu biezumu vai dažādu blīvumu atšķirsies savā starpā kontrasta pakāpē. Interferences kontrasta metodi bieži izmanto kopā ar citām mikroskopijas metodēm, jo īpaši ar novērošanu polarizētā gaismā. Tā lietošana kopā ar ultravioleto mikroskopiju ļauj, piemēram, noteikt nukleīnskābju saturu objekta kopējā sausā masā.
Polarizācijas mikroskopija
Polarizācijas mikroskopija ir izotropisku objektu novērošanas metode, t.i., polarizētā gaismā. Submikroskopisko daļiņu sakārtota orientācija. Polarizējošā mikroskopa kondensatora priekšā ir novietots polarizators, kas pārraida gaismas viļņus ar noteiktu polarizācijas plakni. Pēc parauga un objektīva tiek novietots analizators, kas var pārraidīt gaismu ar tādu pašu polarizācijas plakni. Ja pēc tam analizatoru pagriež par 90° attiecībā pret pirmo, gaisma caur to neizies. Gadījumā, ja starp šādām krustotām prizmām atrodas objekts, kuram ir spēja polarizēt gaismu, tas būs redzams kā spīdošs tumšā laukā. Izmantojot polarizējošo mikroskopu, var pārbaudīt, piemēram, micellu orientētu izvietojumu augu šūnu sieniņās.
Pieņemsim, ka jums ir saplīsis pāris polarizācijas brilles (polarizatori). Ja paņemsi vienu glāzi un pagriezīsi to attiecībā pret otru, iegūsi tumsu. Necaurredzamības pakāpe ir atkarīga no polarizatoru kvalitātes.
95-98% gaismas slāpēšana ir lieliska; ja tas ir daudz mazāks, parādās netīri pelēks nokrāsa.Polarizatoru relatīvais novietojums, iegūstot tumšo lauku, tiek saukts par krustu, iegūstot gaišāko nulli - paralēli.
Pirms pievērsties polarizācijas mikroskopijai, atgriezīsimies pie iepriekš minētā patologa.
Pievienosim tā spilgtā lauka vai fāzes kontrasta mikroskopam starp binokulāro stiprinājumu un mikroskopa korpusu ierīci, kas ļaus optiskajā ceļā ievadīt polarizējošo elementu (analizatoru). Novietosim zem kondensatora vēl vienu polarizējošo elementu (polarizatoru) un griezīsim līdz pilnīgai tumsai (analizators un polarizators ir krustoti); Ļaujiet mums noteikt viņu pozīciju. Ievietosim šajā ierīcē (starp binokulāro stiprinājumu un mikroskopa korpusu) ievelkamu turētāju ar kompensatoru - pirmās kārtas sarkano plāksnīti. Pieņemsim, ka patologs pārbauda audu paraugu un pamana objektu, kas izskatās pēc kristāla. Viņš uzstāda analizatoru, pagriež polarizatoru šķērsām un pārbauda objektu. Ja tas ir kristāls vai kristālisks veidojums, tad tas spīd tā, it kā aiz caurspīdīga ekrāna būtu ieslēgta gaisma. Patologs vēl nevar noteikt, vai tas ir urīnskābes vai kalcija kristāls. Viņš ievada staru gaitā pirmās kārtas sarkanu plāksni un pagriež to no vienas iestatītās pozīcijas uz citu: kristāls kļūst vai nu sarkans, vai zaļš. Tādā veidā var noteikt kristāla raksturu. Tad patologs no optiskā ceļa noņem analizatoru un, ja vēlas, polarizatoru un turpina strādāt (pētāmā parauga zona paliek redzes laukā).
Tagad pievērsīsim uzmanību polarizējošajam mikroskopam. Tas ietver daudzas sastāvdaļas, kas atrodas parastā spilgtā lauka mikroskopā, jo tas ietver parauga pārbaudi spilgtā laukā starp polarizējošiem elementiem.
Diezgan bieži, īpaši mācot studentus, tiek izmantoti monokulāri polarizējošie mikroskopi to zemo izmaksu dēļ. Profesori dod priekšroku binokulārajiem modeļiem. Binokulārā galva var būt aprīkota gan ar fiksētu, gan ar fokusējošu Bertrand objektīvu, kas nepieciešams izpētei
(tā funkcijas ir aprakstītas tālāk). Starp sprauslu un korpusu ir daļa, kurā atrodas analizators, un slots kompensatora uzstādīšanai.
Mikroskopam ir apaļa un grozāma stadija, kas ļauj pārbaudīt paraugu, pagriežot to starp krustenisko analizatoru un polarizatoru. Galds ir aprīkots arī ar skalu tā rotācijas mērīšanai grādos un loka minūtēs. Zem objekta stadijas (parasti zem kondensatora) atrodas pagriežams polarizators, kura pozīcija ir fiksēta 0, 45° un 90° leņķī pret analizatora pozīciju. Protams, mikroskops ir aprīkots ar apertūras diafragmu un, kā likums, filtra turētāju.
Mono- vai binokulārā stiprinājuma okulāram ir krustojums. Visa centrēšana tiek veikta attiecībā pret šo krustojumu, sagatavošanās tiek pagriezta arī ap šī krusta centru.
Atšķirība starp mehānisko stadiju ir tāda, ka tai jābūt zemai, lai lēcas, griežoties, pret to nesaskartos. Ļoti bieži tas ir mērīšanas galds, kas, pārvietojot austrumu-rietumu vai ziemeļu-dienvidu virzienā, tiek secīgi fiksēts noteiktos intervālos. Iedomājieties bumbu, kas iekrīt rievā – tā darbojas fiksācijas mehānisms. Var paņemt priekšmetu, kas ir asāks par bumbu – efekts būs tāds pats. Pagriežot lēcas, bloķēšanas mehānisms notur katru objektīvu staru optiskajā ceļā.
Lai saskaitītu dažādas sastāvdaļas plānā šķēlītē, tām uz skaitītāja tiek piešķirti cipari no 1 līdz 9. Skaitlis 10 ir paredzēts emisijām vai summēšanai. Pētnieks pārvieto preparātu, līdz galds ir fiksēts, un skatās, vai viens no 9 komponentiem atrodas krustpunktā. Ja neviena no tām nav, tad izvēlieties skaitli 10. Saskaitot materiālu uz letes, uz skaitļa jānorāda katras sastāvdaļas numurs un viss pārējais. Pēc visa preparāta apskates varat aprēķināt, cik procentu jebkura no 9 materiāla sastāvdaļām.
Kompensators ir uzstādīts mikroskopā 45° leņķī ziemeļu-dienvidu un austrumu-rietumu virzienā.
Lielākā daļa komponentu ir redzami vienādi neatkarīgi no tā, kā tie ir novietoti attiecībā pret kompensatoru, bet dažiem ir nepieciešama rotācija, kas ir vēl viens iemesls, kāpēc pakāpei jābūt pagriežamai. Mēs neiedziļināsimies sīkāk par dažādu kompensatoru vai ķīļu funkcijām, jo par šo tēmu varat iegādāties īpašu grāmatu. Minēsim tikai dažus nosaukumus: 1/4 viļņa garuma plāksne - kvarca ķīlis, kuram var būt 6, 30 vai 120 pasūtījumi; pirmās kārtas sarkanā plāksne (tai ir trīs citi nosaukumi, kas norāda uz to lietotāju vecumu: lēnās gaismas plāksne, jutīga toņa plāksne un ģipša plāksne, vecākais).
Apskatīsim jēdzienu “kārtība”. Gaismai laužot caur prizmu, kļūst redzamas visas spektra krāsas, tad tās kļūst bālākas (trešā, ceturtā utt. krāsu secību kopas). Nulles kārtība ir melnā gaisma pašā spektra sākumā. Pirmās kārtas sarkanā plāksne, kā norāda nosaukums, ir līdzvērtīga sarkanajai pirmajā krāsu secībā.
Bertrand lēca kombinācijā ar okulāru nodrošina papildu tēmēkli, kas ļauj aplūkot traucējumu figūras mikrolēcas izejas zīlītē, kamēr pats mikroskops ir fokusēts uz konkrētu parauga graudu. Ja ģeologam ir jāidentificē materiāls, viņš pagriež plānu minerāla daļu starp krustenisko polarizatoru un analizatoru. Šajā gadījumā ir redzamas 2 krāsas (un tikai 2), un, lai pārveidotu vienu krāsu citā, ir nepieciešams konkrēts preparāta griešanās leņķis. Lielāko daļu minerālu var identificēt šādā veidā. Tomēr daži minerāli ir tik līdzīgi pēc krāsas un rotācijas leņķiem, ka traucējumu modeļi ir vienīgais veids, kā tos identificēt.
Petrogrāfija pēta naftas ģeoloģiju. Petrogrāfiskajam mikroskopam nav Bertrāna objektīva, jo tā lietotājiem nav nepieciešams traucējumu modelis.
Standarta ģeoloģiskie darbi tiek veikti plānās daļās. Tas sastāv no plānas akmens daļas, noslīpēta, iemontēta epoksīdsveķos uz 1x2 collu stikla priekšmetstikliņa un pēc tam vēlreiz noslīpēta tā, lai sekcijas biezums nepārsniegtu 15 mikronus; Pēc tam preparātu novieto uz skatuves un pārklāj ar segstikliņu. Šādi preparāti tiek novēroti gaismā, kas nāk no polarizatora caur plānu sekciju.
Visi šādi pētījumi attiecas uz spilgta lauka mikroskopu, kuram ir pievienots polarizators, analizators un kompensators.
Rūdas pētnieks var sākt sagatavot paraugu tāpat kā plānu daļu, padarot to 6–10 mm biezu un noslīpējot virsmu. Tam būs nepieciešams epi-apgaismojums, tāpēc starp binokulāra galvu un mikroskopa korpusu ir jānovieto apgaismotājs. Būs gan spuldzīte, gan transformators; polarizators, analizators, kompensators; apertūras un lauka diafragmas, dihromiskais spogulis utt. d.
Polarizētās gaismas lēcas darbojas savādāk nekā standarta lēcas. Galvenais ir tas, ka tiem jābūt brīviem no iekšējās spriedzes. Lēcu spriegums rodas metāla rāmjiem piespiežoties pret objektīva malām. Vērojot caur mikroskopu, tas parādās kā baltas gaismas zibspuldze, kas nāk no spiediena punkta virzienā uz centru.
Ražotāji rūpīgi pārbauda lēcu iekšējo spriegojumu. Lēcas, kurām nav spriedzes, tiek piegādātas ar polarizējošiem mikroskopiem par augstu cenu; un lēcas ar spriegojumu ir iekļautas bioloģiskajos mikroskopos, kuros spriedze nespēlē nekādu lomu, vai arī tiek pilnībā noraidīta.
Mēs esam parādījuši jums nepieciešamību pēc mūsu lēcām. Šie objektīvi ir izstrādāti un pielāgoti darbam ar paraugiem, kas ir zem 0,17 mm bieziem segstikliņiem.
Pārbaudot rūdu mikroskopā, pulētā virsma nav pārklāta ar pārklājumu. Šādam darbam mums ir vajadzīgas lēcas, kas nebūs noregulētas attiecībā pret pārsegu, vai lēcas metalogrāfijai, bet bez spriedzes.
10x objektīvus var izmantot ar segstikliņiem vai bez tiem. Rūdas mikroskopiem būs nepieciešami 20 reižu vai spēcīgāki objektīvi, kas tiek koriģēti, lai nebūtu pārklājuma.
Mūsu standarta polarizējošajam mikroskopam parasti ir 5x, 10x un 40x objektīvi. Revolverim ir 4 lēcu ligzdas, tāpēc mēs pievienojām otru 40x objektīvu priekšmetstikliņiem bez vāka, tādējādi izveidojot dubultās gaismas polarizācijas mikroskopu. Iepriekš, aprakstot Huygens okulārus, piezīmē tika teikts, ka tie nenodrošina krāsu korekciju vai hromatiskās aberācijas kompensāciju, un, lai atrisinātu šo problēmu, vajadzētu atsaukties uz sadaļu “Polarizācijas mikroskopija”.
Kad esam izlēmuši par krāsu nozīmi, mēs nevēlamies, lai okulārs vai objektīvs redzamības laukā radītu krāsas, kas nepieder preparātam. Mēs zinām, ka polarizējošajiem mikroskopiem tika izvēlētas lēcas bez spriedzes, jo tām trūkst spriegošanas un krāsu korekcijas. Tāpēc ir ļoti svarīgi, lai okulāri būtu arī bez krāsu korekcijas vai kompensācijas. Šī iemesla dēļ polarizējošie okulāri parasti tiek pārveidoti par Huygens okulāriem. Dažkārt tiek izmantoti arī plaša lauka okulāri, taču īpaši pārbaudīti, lai tie atbilstu polarizējošajam mikroskopam.
Esiet piesardzīgs, aprēķinot polarizējošā mikroskopa kopējo palielinājumu. Analizatora un kompensatora uzstādīšanai izmantotās ierīces augstuma dēļ binokulārais stiprinājums ir papildus palielināts. Piemēram, mikroskopam, kas aprīkots ar revolveri 3 lēcām, ir papildu palielinājums 1,4x, bet mikroskopam ar revolveri 4 lēcām ir papildu palielinājums 1,8x.
Attēlā 10. attēlā parādīts vispārējs polarizējošā mikroskopa skats.
1. 10x plaša lauka okulārs ar garu acu reljefu
2. Bertrāna objektīvs
3. Slots kompensatoram
4. Bez spriedzes mikro lēcas
5. Rotējoša skatuve ar skalu uz ciparnīcas; dalījuma cena 1°
6. Kondensators
7. Rotējošais polarizators ar iespēju noņemt starus no ceļa
8. Lauka varavīksnenes diafragma
9. Fokusējošs 10x okulārs ar vadotni un krustiņu
10. Binokulāra galva ar 360° rotāciju un 30° slīpuma leņķi pret optisko asi
11. Binokļa stiprinājuma skrūve
12. Analizatora turētājs
13. Revolveris ar mikro lēcām
14. Mikroskopa statīvs
15. Zāļu turētāju klipši
16. Regulators kondensatora kronšteina augstuma pārvietošanai
17. Koaksiāli izvietoti rupji un smalki fokusēšanas mehānismi
18. Mikroskopa pamatne ar iebūvētu transformatoru un 6 V, 30 W halogēna lampas spilgtuma regulēšanu.