Polarizētā mikroskopija. Mikroorganismu intracelulāro struktūru vizualizācija, izmantojot gaismas mikroskopiju. Fāzes kontrasta mikroskopijas metode
Polarizācijas mikroskopijaļauj iegūt nekrāsotu anizotropu struktūru (piemēram, kolagēna šķiedru, miofibrilu vai mikrobu šūnu) attēlus. Metodes princips ir balstīts uz objekta izpēti gaismā, ko veido divi stari, kas polarizēti savstarpēji perpendikulārās plaknēs.
Rīsi. 11-4. Fluorescences mikroskopa diagramma.Interferences mikroskopija
Interferences mikroskopija apvieno fāzes kontrasta un polarizācijas mikroskopijas principus. Metode tiek izmantota, lai iegūtu kontrastējošu nekrāsotu objektu trīsdimensiju attēlu. Metodes princips ir balstīts uz gaismas plūsmas sadalīšanu mikroskopā; viens stars iziet caur objektu, otrs - tam garām. Abi stari ir savienoti pie okulāra un traucē viens otru.
Rīsi. 11-5. Tiešā imunofluorescence. Tiešā metode ietver AT izmantošanu, kas marķēta ar fluorescējošu krāsu līdz interesējošajam Ag; AT mijiedarbojas ar Ag to lokalizācijas vietās, kas ļauj vizualizēt etiķeti.
Fluorescences mikroskopija
Fluorescences mikroskopijas metode pamatojoties uz dažu vielu spēju spīdēt, pakļaujot īsviļņu starojumam. Šajā gadījumā izstarotās gaismas viļņi ir garāki par viļņu, kas izraisa spīdumu. Citiem vārdiem sakot, fluorescējoši objekti absorbē viena viļņa garuma gaismu un izstaro gaismu citā spektra reģionā (11.-4. att.). Piemēram, ja inducējošais starojums ir zils, tad iegūtais spīdums var būt sarkans vai dzeltens. Šīs vielas (fluoresceīna izocianāts, akridīna oranžs, rodamīns u.c.) izmanto kā fluorescējošas krāsvielas fluorescējošu (luminiscējošu) objektu novērošanai. Fluorescences mikroskopā gaisma no avota (īpaši augsta spiediena dzīvsudraba lampa) iziet cauri diviem filtriem.
Rīsi. 11-6. Netiešā imunofluorescence. Netiešā metode ietver divu dažādu AT izmantošanu. Pirmie AT reaģē ar mikroorganisma Ag, otrie AT (saistīti ar marķējumu) īpaši mijiedarbojas ar pirmajiem AT, kas ir Ag otrajiem AT. Metode ir daudz jutīgāka nekā tiešā imunofluorescence, jo vairākas otrās AT molekulas saistās ar katru pirmās AT molekulu.
Pirmais (zilais) filtrs aiztur gaismu parauga priekšā un pārraida tāda viļņa garuma gaismu, kas ierosina parauga fluorescenci. Otrais (dzeltenais) bloķē zilo gaismu, bet pārraida dzelteno, sarkano, zaļo gaismu, ko izstaro fluorescējošais objekts un ko uztver acs. Parasti pētāmos mikroorganismus iekrāso tieši vai izmantojot AT vai lektīnus, kas marķēti ar fluorohromiem. Zāles mijiedarbojas ar Ag vai citām objekta ligandu saistošām struktūrām. Fluorescences mikroskopija ir atradis plašu pielietojumu imūnķīmisko reakciju rezultātu vizualizēšanai, pamatojoties uz fluorescējošām krāsvielām iezīmētā AT specifisko mijiedarbību ar pētāmā objekta Ag. Iespējas imunofluorescējošas reakcijas ir parādīti attēlā. 11-5 un 11-6.
Nosūtiet savu labo darbu zināšanu bāzē ir vienkārši. Izmantojiet zemāk esošo veidlapu
Studenti, maģistranti, jaunie zinātnieki, kuri izmanto zināšanu bāzi savās studijās un darbā, būs jums ļoti pateicīgi.
Publicēts http://www.allbest.ru/
Ievads
Gaismas mikroskopija
Elektronu mikroskopija
Polarizācijas mikroskopija
1.pielikums
Gaismas mikroskopija
Gaismas mikroskopija ir senākā un tajā pašā laikā viena no visizplatītākajām augu un dzīvnieku šūnu izpētes un izpētes metodēm. Tiek pieņemts, ka šūnu izpētes sākums bija tieši ar gaismas optiskā mikroskopa izgudrošanu. Gaismas mikroskopa galvenā īpašība ir gaismas mikroskopa izšķirtspēja, ko nosaka gaismas viļņa garums. Gaismas mikroskopa izšķirtspējas robežu nosaka gaismas viļņa garums, ar optisko mikroskopu tiek pētītas struktūras, kuru minimālie izmēri ir vienādi ar gaismas starojuma viļņa garumu. Daudzām šūnām ir līdzīgs optiskais blīvums, un pirms mikrokopēšanas tām ir nepieciešama iepriekšēja apstrāde, pretējā gadījumā tās ir praktiski neredzamas parastā gaismas mikroskopā. Lai tās būtu redzamas, tiek izmantotas dažādas krāsvielas ar noteiktu selektivitāti. Izmantojot selektīvās krāsvielas, kļūst iespējams sīkāk izpētīt šūnas iekšējo struktūru.
Piemēram:
hematoksilīna krāsviela krāso dažus kodola komponentus zilā vai violetā krāsā;
pēc secīgas apstrādes ar floroglucinolu un pēc tam ar sālsskābi lignified šūnu membrānas kļūst ķiršu sarkanas;
Sudāna III krāsviela iekrāso suberizētās šūnu membrānas rozā krāsā;
vājš joda šķīdums kālija jodīdā padara cietes graudus zilus.
Veicot mikroskopiskos izmeklējumus, lielākā daļa audu tiek fiksēti pirms krāsošanas.
Pēc nostiprināšanas šūnas kļūst caurlaidīgas pret krāsvielām, un šūnu struktūra tiek stabilizēta. Viens no visizplatītākajiem fiksatoriem botānikā ir etilspirts.
Preparāta sagatavošanas laikā mikrokopēšanai uz mikrotoma tiek izgatavotas plānas daļas (1. pielikums, 1. att.). Šajā ierīcē tiek izmantots maizes griezēja princips. Augu audiem tiek izgatavotas nedaudz biezākas sekcijas nekā dzīvnieku audiem, jo augu šūnas ir salīdzinoši lielākas. Augu audu sekciju biezums priekš - 10 mikroni - 20 mikroni. Daži audi ir pārāk mīksti, lai tos uzreiz nogrieztu. Tāpēc pēc fiksācijas tos ielej izkausētā parafīnā vai īpašos sveķos, kas piesātina visu audumu. Pēc atdzesēšanas veidojas ciets bloks, kuru pēc tam sagriež, izmantojot mikrotomu. Tas izskaidrojams ar to, ka augu šūnām ir spēcīgas šūnu sienas, kas veido audu rāmi. Lignified čaumalas ir īpaši spēcīgas.
Izmantojot pildījumu sagatavošanas laikā, iegriezums rada risku sabojāt šūnu struktūru, lai to novērstu, izmantojiet ātrās sasaldēšanas metodi. Izmantojot šo metodi, jūs varat iztikt bez nostiprināšanas un pildīšanas. Saldētus audus griež, izmantojot īpašu mikrotomu – kriotomu (1. pielikums, 2. att.).
Saldētās sekcijas labāk saglabā dabiskās struktūras iezīmes. Tomēr tos ir grūtāk pagatavot, un ledus kristālu klātbūtne sabojā dažas detaļas.
fāzes kontrasts (1. pielikums, 3. att.) un interferences mikroskopi (1. pielikums, 4. att.) ļauj izmeklēt dzīvās šūnas mikroskopā ar skaidru to struktūras detaļu izpausmi. Šajos mikroskopos tiek izmantoti 2 gaismas viļņu stari, kas mijiedarbojas (superpozē) viens pret otru, palielinot vai samazinot to viļņu amplitūdu, kas iekļūst acī no dažādām šūnas sastāvdaļām.
Gaismas mikroskopijai ir vairākas šķirnes.
Spilgta lauka metode un tās šķirnes
Raidītā gaismas lauka metode izmanto caurspīdīgu preparātu izpētē, kas satur gaismu absorbējošas daļiņas un detaļas (plānas krāsainas dzīvnieku un augu audu sekcijas, plānas minerālvielu daļas). Ja zāles nav, gaismas stars no kondensatora, kas iet cauri objektīvam, rada vienmērīgi apgaismotu lauku okulāra fokusa plaknes tuvumā. Ja preparātā ir absorbējošs elements, notiek uz to krītošās gaismas daļēja absorbcija un daļēja izkliede, kas izraisa attēla izskatu. Metodi iespējams izmantot arī, novērojot neabsorbējošus objektus, taču tikai tad, ja tie izkliedē apgaismojošo staru kūli tik spēcīgi, ka ievērojama tā daļa neietilpst objektīvā.
Slīpa apgaismojuma metode- iepriekšējās metodes variants. Atšķirība starp tām ir tāda, ka gaisma ir vērsta uz objektu lielā leņķī pret novērošanas virzienu. Dažreiz tas palīdz atklāt objekta “reljefu” ēnu veidošanās dēļ.
Spilgta lauka metode atstarotā gaismā izmanto, pētot necaurspīdīgus gaismu atstarojošus objektus, piemēram, plānas metāla vai rūdas daļas. Preparāts tiek izgaismots (no apgaismotāja un caurspīdīga spoguļa) no augšas, caur lēcu, kas vienlaikus pilda kondensatora lomu. Attēlā, ko lēca veido plaknē kopā ar caurules lēcu, ir redzama preparāta struktūra, pateicoties tā elementu atstarošanas spējai atšķirībai; Spilgtajā laukā izceļas arī neviendabības, kas izkliedē uz tiem krītošo gaismu.
Tumšā lauka metode un tās variācijas
Pārraidītā gaiši tumšā lauka metode izmanto, lai iegūtu attēlus no caurspīdīgiem, neuzsūcošiem objektiem, kurus nevar redzēt, izmantojot spilgtā lauka metodi. Bieži vien tie ir bioloģiski objekti. Gaisma no apgaismotāja un spoguļa tiek novirzīta uz preparātu ar speciāli izstrādātu kondensatoru - tā saukto. tumšā lauka kondensators. Izejot no kondensatora, galvenā gaismas staru daļa, kas, izejot cauri caurspīdīgajam preparātam, nemainīja virzienu, veido staru kūli doba konusa formā un neietilpst objektīvā (kas atrodas šī konusa iekšpusē) . Attēls mikroskopā tiek veidots, izmantojot tikai nelielu daļu no stariem, ko izkliedē zāļu mikrodaļiņas, kas atrodas uz priekšmetstikliņa konusā un iziet cauri objektīvam. Redzes laukā uz tumša fona ir redzami gaiši zāļu strukturālo elementu attēli, kas atšķiras no apkārtējās vides ar savu refrakcijas koeficientu. Lielām daļiņām ir tikai spilgtas malas, kas izkliedē gaismas starus. Izmantojot šo metodi, pēc attēla izskata nav iespējams noteikt, vai daļiņas ir caurspīdīgas vai necaurspīdīgas, vai tām ir augstāks vai zemāks laušanas koeficients salīdzinājumā ar apkārtējo vidi.
Elektronu mikroskopija
Pirmo elektronu mikroskopu 1931. gadā uzbūvēja Knolls un Ruska Vācijā. Tikai 50. gados tika izstrādātas metodes sekciju izgatavošanai ar nepieciešamajām īpašībām.
Elektronu mikroskopijas grūtības ir tādas, ka bioloģisko paraugu pētīšanai nepieciešama īpaša preparātu apstrāde.
Pirmā grūtība ir tā, ka elektroniem ir ļoti ierobežota iespiešanās spēja, tāpēc ir jāsagatavo īpaši plānas sekcijas, kuru biezums ir 50–100 nm. Lai iegūtu šādas plānas sekcijas, audi vispirms tiek piesūcināti ar sveķiem: sveķi polimerizējas, veidojot cietu plastmasas bloku. Pēc tam, izmantojot asu stikla vai dimanta nazi, sekcijas tiek sagrieztas uz īpaša mikrotoma.
Ir vēl viena grūtība: kad elektroni iziet cauri bioloģiskajiem audiem, kontrasta attēls netiek iegūts. Lai iegūtu kontrastu, plānas bioloģisko paraugu daļas tiek piesūcinātas ar smago metālu sāļiem.
Ir divi galvenie elektronu mikroskopu veidi. Transmisijas (transmisijas) mikroskopā elektronu stars, izejot cauri speciāli sagatavotam paraugam, atstāj savu attēlu uz ekrāna. Mūsdienu transmisijas elektronu mikroskopa izšķirtspēja ir gandrīz 400 reizes lielāka nekā gaismas izšķirtspēja. Šo mikroskopu izšķirtspēja ir aptuveni 0,5 nm.
Neskatoties uz tik augstu izšķirtspēju, transmisijas elektronu mikroskopiem ir būtiski trūkumi:
jāstrādā ar fiksētiem materiāliem;
attēls uz ekrāna ir divdimensiju (plakans);
Apstrādājot ar smagajiem metāliem, dažas šūnu struktūras tiek iznīcinātas un pārveidotas.
Trīsdimensiju (tilpuma) attēlu iegūst, izmantojot skenējošu elektronu mikroskopu (EM). Šeit stars neiziet cauri paraugam, bet tiek atspoguļots no tā virsmas.
Pārbaudāmo paraugu fiksē un žāvē, pēc tam to pārklāj ar plānu metāla kārtu, ko sauc par ēnojumu (paraugs tiek ieēnots).
Skenējot EM, fokusēts elektronu stars tiek novirzīts uz paraugu (paraugs tiek skenēts). Rezultātā parauga metāla virsma izstaro zemas enerģijas sekundāros elektronus. Tie tiek ierakstīti un pārveidoti par attēlu televīzijas ekrānā. Skenējošā mikroskopa maksimālā izšķirtspēja ir maza, aptuveni 10 nm, bet attēls ir trīsdimensiju.
Elektronu mikroskopijas veidi:
Amplitūdas elektronu mikroskopija- Amplitūdas elektronu mikroskopijas metodes var izmantot, lai apstrādātu amorfu un citu ķermeņu attēlus (kuru daļiņu izmēri ir mazāki par attālumu, kas izšķirts elektronu mikroskopā), kas izkliedē elektronus difūzi. Transmisijas elektronu mikroskopā, piemēram, attēla kontrasts, t.i., attēla spilgtuma atšķirība blakus esošajos objekta apgabalos, pirmkārt, ir proporcionāls šo apgabalu biezuma atšķirībai.
Fāzes elektronu mikroskopija- Kristālisko ķermeņu ar regulārām struktūrām attēlu kontrasta aprēķināšanai, kā arī apgrieztās problēmas risināšanai - objekta struktūras aprēķināšanai no novērotā attēla - tiek izmantotas fāzes elektronu mikroskopijas metodes. Tiek apskatīta elektronu viļņa difrakcijas problēma uz kristāla režģa, kuras risināšanā papildus tiek ņemta vērā elektronu neelastīgā mijiedarbība ar objektu: izkliede ar plazmām, fononiem uc Transmisijas elektronu mikroskopos un augstas izšķirtspējas skenēšanas pārraidē tiek iegūti elektronu mikroskopi, atsevišķu molekulu vai smago elementu atomu attēli. Izmantojot fāzes elektronu mikroskopijas metodes, pēc attēliem iespējams rekonstruēt kristālu un bioloģisko makromolekulu trīsdimensiju struktūru.
Kvantitatīvā elektronu mikroskopija- Kvantitatīvās elektronmikroskopijas metodes ir dažādu pētāmā parauga vai procesa parametru precīza mērīšana, piemēram, lokālo elektrisko potenciālu, magnētisko lauku mērīšana, virsmas reljefa mikroģeometrija u.c.
Lorenca elektronu mikroskopija- Lorenca elektronu mikroskopijas izpētes joma, kurā tiek pētītas Lorenca spēka izraisītās parādības, ir iekšējie magnētiskie un elektriskie lauki vai ārējie izkliedētie lauki, piemēram, magnētisko domēnu lauki plānās kārtiņās, feroelektriskie domēni, galviņu lauki. informācijas magnētiskai ierakstīšanai u.c.
Polarizācijas mikroskopija
Polarizācijas mikroskopija ir novērošanas metode polarizētā gaismā tādu preparātu mikroskopiskai pārbaudei, kas satur optiski anizotropus elementus (vai pilnībā sastāv no šādiem elementiem). Tajos ietilpst daudzi minerāli, graudi sakausējumu plānās daļās, daži dzīvnieku un augu audi utt. Novērošanu var veikt gan caurlaidīgā, gan atstarotajā gaismā. Apgaismotāja izstarotā gaisma tiek izlaista caur polarizatoru. Tam piešķirtā polarizācija mainās, gaismai izejot cauri preparātam (vai atspīdumam no tā). Šīs izmaiņas tiek pētītas, izmantojot analizatoru un dažādus optiskos kompensatorus. Analizējot šādas izmaiņas, var spriest par anizotropo mikroobjektu galvenajām optiskajām īpašībām: divkāršās laušanas stiprumu, optisko asu skaitu un to orientāciju, polarizācijas plaknes rotāciju un dihroismu.
Fāzes kontrasta metode
Metode fāzes kontrasts un tā šķirne - t.s. metodi "anoptrāls" kontrasts ir paredzēti, lai iegūtu caurspīdīgu un bezkrāsainu objektu attēlus, kas ir neredzami, novērojot, izmantojot spilgtā lauka metodi. Tajos ietilpst, piemēram, dzīvi nekrāsoti dzīvnieku audi. Metodes būtība ir tāda, ka pat ar ļoti nelielām dažādu preparāta elementu refrakcijas koeficientu atšķirībām gaismas vilnis, kas iet cauri tiem, piedzīvo dažādas fāzes izmaiņas (iegūst tā saukto fāzes reljefu). Šīs fāzu izmaiņas, kuras neuztver tieši ne acs, ne fotoplate, ar speciālas optiskās ierīces palīdzību tiek pārvērstas gaismas viļņa amplitūdas izmaiņās, t.i., spilgtuma izmaiņās (“amplitūdas reljefs”), jau redzams ar aci vai ierakstīts uz gaismjutīgā slāņa. Citiem vārdiem sakot, iegūtajā redzamajā attēlā spilgtuma sadalījums (amplitūda) atveido fāzes reljefu. Šādā veidā iegūto attēlu sauc par fāzes kontrastu.
Tipiska metodes darbības shēma: kondensatora priekšējā fokusā ir uzstādīta diafragma ar diafragmu, kuras caurumam ir gredzena forma. Tā attēls parādās netālu no objektīva aizmugures fokusa un tā sauktā. fāzes plāksne, uz kuras virsmas ir gredzenveida izvirzījums vai gredzenveida rieva, ko sauc par fāzes gredzenu. Fāzes plāksne ne vienmēr tiek novietota objektīva fokusā - bieži fāzes gredzens tiek uzlikts tieši uz vienas no objektīva lēcām.
Jebkurā gadījumā stariem no apgaismotāja, kas preparātā netiek novirzīti, radot diafragmas attēlu, pilnībā jāiziet cauri fāzes gredzenam, kas tos ievērojami vājina (padara absorbējošu) un maina to fāzi par l/4 (l ir gaismas viļņa garums). Un stari, pat nedaudz novirzīti (izkliedēti) preparātā, iziet cauri fāzes plāksnei, apejot fāzes gredzenu, un netiek pakļauti papildu fāzes nobīdei.
Ņemot vērā fāzes nobīdi preparāta materiālā, kopējā fāzu starpība starp novirzītajiem un nenovirzītajiem stariem ir tuvu 0 vai l/2, un gaismas iejaukšanās rezultātā preparāta attēla plaknē tie veidojas. manāmi uzlabo vai vājina viens otru, sniedzot kontrastējošu preparāta struktūras attēlu. Novirzītajiem stariem ir ievērojami mazāka amplitūda, salīdzinot ar nenovirzītajiem, tāpēc, vājinot galveno staru fāzes gredzenā, tuvinot amplitūdas vērtības, tiek panākts arī lielāks attēla kontrasts.
Metode ļauj atšķirt mazus konstrukcijas elementus, kuriem ir īpaši zems kontrasts spilgtā lauka metodē. Caurspīdīgas daļiņas, kuru izmērs ir salīdzinoši mazs, izkliedē gaismas starus tik mazos leņķos, ka šie stari iziet kopā ar tiem, kas nav novirzīti caur fāzes gredzenu. Šādām daļiņām fāzes kontrasta efekts rodas tikai to kontūru tuvumā, kur notiek spēcīga izkliede.
Infrasarkanā novērošanas metode
Metode novērojumi infrasarkanajā starā(IR) stariem arī ir nepieciešams acij neredzamu attēlu pārveidot par redzamu, izmantojot fotogrāfiju vai elektronu optisko pārveidotāju. IR mikroskopija ļauj izpētīt objektu iekšējo struktūru, kas ir necaurredzami redzamā gaismā, piemēram, tumši stikli, daži kristāli un minerāli utt.
Ultravioletā novērošanas metode
Metode novērojumi ultravioletajos (UV) starosļauj palielināt mikroskopa maksimālo izšķirtspēju. Metodes galvenā priekšrocība ir tā, ka daudzu vielu daļiņas, kas ir caurspīdīgas redzamā gaismā, spēcīgi absorbē noteikta viļņa garuma UV starojumu un tāpēc ir viegli atšķiramas UV attēlos. Daudzām augu un dzīvnieku šūnās esošajām vielām (purīna bāzes, pirimidīna bāzes, lielākā daļa vitamīnu, aromātiskās aminoskābes, daži lipīdi, tiroksīns u.c.) ir raksturīgi absorbcijas spektri UV apgabalā.
Tā kā ultravioletie stari cilvēka acij nav redzami, attēlus UV mikroskopijā ieraksta vai nu fotogrāfiski, vai izmantojot elektronu optisko pārveidotāju vai fluorescējošu ekrānu. Zāles tiek fotografētas trīs UV spektra viļņu garumos. Katrs no iegūtajiem negatīviem tiek izgaismots ar noteiktu redzamās gaismas krāsu (piemēram, zilu, zaļu un sarkanu), un tie visi tiek vienlaikus projicēti vienā ekrānā. Rezultāts ir objekta krāsains attēls parastajās krāsās atkarībā no zāļu absorbcijas spējas ultravioletajā gaismā.
Mikrofotografēšana un mikrokino- tā ir attēlu iegūšana uz gaismjutīgiem slāņiem, izmantojot mikroskopu. Šo metodi plaši izmanto kopā ar visām citām mikroskopiskās izmeklēšanas metodēm. Mikrofotogrāfijām un mikrokinogrāfijā ir nepieciešama neliela mikroskopa optiskās sistēmas pārstrukturēšana – tas atšķiras no okulāra fokusa vizuālas novērošanas attiecībā pret objektīva sniegto attēlu. Mikrofotografēšana nepieciešama, dokumentējot pētījumus, pētot objektus acij neredzamos UV un IR staros (skat. augstāk), kā arī objektus ar zemu luminiscences intensitāti. Mikrofilmu fotografēšana ir neaizstājama, pētot procesus, kas norisinās laika gaitā (audu šūnu un mikroorganismu dzīvībai svarīgā darbība, kristālu augšana, vienkāršu ķīmisku reakciju rašanās utt.).
Interferences kontrasta metode
Interferences kontrasta metode (interferences mikroskopija) sastāv no katra stara sadalīšanas, kad tas nonāk mikroskopā. Viens no iegūtajiem stariem tiek virzīts caur novēroto daļiņu, otrs - tai garām pa to pašu vai papildu mikroskopa optisko atzaru. Mikroskopa okulāra daļā abi stari atkal ir savienoti un traucē viens otru. Kondensators un objektīvs ir aprīkoti ar divkāršās laušanas plāksnēm, no kurām pirmā sadala sākotnējo gaismas staru divos staros, bet otrā tos atkal apvieno. Viens no stariem, kas iet caur objektu, aizkavējas fāzē (iegūst ceļa atšķirību salīdzinājumā ar otro staru). Šīs aizkaves lielumu mēra ar kompensatoru. Šī metode ļauj novērot caurspīdīgus un bezkrāsainus objektus, taču to attēli var būt arī daudzkrāsaini (interferences krāsas). Šī metode ir piemērota dzīvo audu un šūnu pētīšanai un daudzos gadījumos tiek izmantota šim nolūkam. Interferences kontrasta metodi bieži izmanto kopā ar citām mikroskopijas metodēm, jo īpaši ar novērošanu polarizētā gaismā. Tā lietošana kopā ar ultravioleto mikroskopiju ļauj, piemēram, noteikt nukleīnskābju saturu objekta kopējā sausā masā.
Pētījuma metode luminiscences gaismā
Metode pētījumi luminiscences gaismā sastāv no mikroobjektu zaļi oranžā mirdzuma novērošanas mikroskopā, kas rodas, tos apgaismojot ar zili violetu gaismu vai acij neredzamiem ultravioletajiem stariem. Mikroskopa optiskajā shēmā tiek ievadīti divi gaismas filtri. Viens no tiem ir novietots kondensatora priekšā. Tas pārraida starojumu no apgaismotāja avota tikai tajos viļņu garumos, kas ierosina vai nu paša objekta luminiscenci (iekšējā luminiscence), vai speciālās krāsvielas, ko ievada preparātā un absorbē tā daļiņas (sekundārā luminiscence). Otrais filtrs, kas tiek uzstādīts aiz objektīva, pārraida tikai luminiscējošu gaismu uz novērotāja aci (vai uz gaismjutīgo slāni). Fluorescējošā mikroskopija izmanto preparātu apgaismojumu gan no augšas (caur lēcu, kas šajā gadījumā kalpo arī kā kondensators), gan no apakšas, caur parasto kondensatoru. Metode ir atradusi plašu pielietojumu mikrobioloģijā, virusoloģijā, histoloģijā, citoloģijā, pārtikas rūpniecībā, augsnes izpētē, mikroķīmiskajā analīzē un defektu noteikšanā. Šāda pielietojuma dažādība ir izskaidrojama ar ļoti augstu acs krāsu jutību un pašgaismojoša objekta attēla augstu kontrastu uz tumša, neluminiscējoša fona.
Replikas metode
Reprodukcijas metodi izmanto, lai pētītu masīvu ķermeņu virsmas ģeometrisko struktūru. No šāda ķermeņa virsmas tiek ņemts nospiedums plānas oglekļa, kolodija, formvāra u.c. plēves veidā, atkārtojot virsmas reljefu un pārbaudīts transmisijas elektronu mikroskopā. Parasti slīdošā (mazā pret virsmu) leņķī uz replikas vakuumā tiek izsmidzināts smagā metāla slānis, kas spēcīgi izkliedē elektronus, aizēnot ģeometriskā reljefa izvirzījumus un ieplakas.
Dekorēšanas metode
Dekorēšanas metode pārbauda ne tikai virsmu ģeometrisko struktūru, bet arī mikrolaukus, ko izraisa dislokāciju klātbūtne, punktveida defektu uzkrāšanās, kristālisko virsmu augšanas stadijas, domēna struktūra utt. Saskaņā ar šo metodi ļoti plāns dekorācijas daļiņu slānis. (Au atomi) vispirms tiek nogulsnēts uz parauga virsmas, Pt utt., pusvadītāju vai dielektriķu molekulas), nogulsnējas galvenokārt vietās, kur ir koncentrēti mikrolauki, un pēc tam tiek noņemta kopija ar dekorēšanas daļiņu ieslēgumiem.
Šūnu frakciju iegūšanai plaši tiek izmantoti dažādi centrifugēšanas veidi: diferenciālā centrifugēšana, zonālā centrifugēšana un līdzsvara blīvuma gradienta centrifugēšana. Teorētiskie un praktiskie jautājumi, kas saistīti ar centrifugēšanu, ir vispusīgi apspriesti Sykes pārskatā.
Diferenciālā centrifugēšana
Diferenciālās centrifugēšanas gadījumā paraugus noteiktu laiku centrifugē ar noteiktu ātrumu, pēc tam noņem supernatantu. Šī metode ir noderīga, lai atdalītu daļiņas, kuru sedimentācijas ātrums ir ļoti atšķirīgs. Piemēram, centrifugēšana 5-10 minūtes pie 3000-5000 d noved pie neskartu baktēriju šūnu sedimentācijas, bet lielākā daļa šūnu fragmentu paliek supernatantā. Šūnu sieniņu fragmentus un lielas membrānas struktūras var granulēt, centrifugējot pie 20 000–50 000 § 20 minūtes, savukārt mazām membrānas pūslīšiem un ribosomām ir nepieciešama centrifugēšana pie 200 000 § 1 stundu, lai granulētu.
Zonālā centrifugēšana
Zonālā centrifugēšana ir efektīva metode tādu struktūru atdalīšanai, kurām ir līdzīgs peldspējas blīvums, bet atšķiras daļiņu forma un masa. Piemēri ietver ribosomu apakšvienību atdalīšanu, dažādas polisomu klases un dažādas formas DNS molekulas. Centrifugēšanu veic vai nu kausa rotoros, vai speciāli izstrādātos zonālos rotoros; Lai novērstu konvekciju centrifugēšanas laikā, kausa rotora vārglāzēs vai zonālā rotora kamerā tiek izveidots vājš gradients (parasti saharoze). Paraugu uzklāj zonas vai šauras sloksnes veidā gradienta kolonnas pašā augšpusē. Subcelulārām daļiņām parasti izmanto saharozes gradientu no 15 līdz 40% (w/v).
Laue metode
izmanto monokristāliem. Paraugu apstaro nepārtraukta spektra stars, stara un kristāla savstarpējā orientācija nemainās. Izkliedētā starojuma leņķiskais sadalījums ir atsevišķu difrakcijas plankumu forma (Lauegram).
Debī-Šērera metode
Izmanto polikristālu un to maisījumu pētīšanai. Paraugā esošo kristālu nejaušā orientācija attiecībā pret krītošo monohromatisko staru kūli pārvērš izkliedētos starus koaksiālo konusu saimē ar krītošo staru uz ass. To attēlam uz fotofilmas (debyegram) ir koncentrisku gredzenu forma, kuru atrašanās vieta un intensitāte ļauj spriest par pētāmās vielas sastāvu.
Šūnu kultūras metode
Dažus audus var sadalīt atsevišķās šūnās, lai šūnas paliktu dzīvas un bieži vien būtu spējīgas vairoties. Šis fakts galīgi apstiprina priekšstatu par šūnu kā dzīvu vienību. Sūkli, primitīvu daudzšūnu organismu, var sadalīt šūnās, izberžot to caur sietu. Pēc kāda laika šīs šūnas atkal savienojas un veido sūkli. Dzīvnieku embrionālos audus var panākt, lai tie atdalītos, izmantojot fermentus vai citus līdzekļus, kas vājina saites starp šūnām.
Amerikāņu embriologs R. Garisons (1879-1959) bija pirmais, kurš parādīja, ka embrionālās un pat dažas nobriedušās šūnas var augt un vairoties ārpus ķermeņa piemērotā vidē. Šo paņēmienu, ko sauc par šūnu kultivēšanu, pilnveidoja franču biologs A. Kerels (1873-1959). Augu šūnas var audzēt arī kultūrā, taču, salīdzinot ar dzīvnieku šūnām, tās veido lielākus pudurus un ir ciešāk savienotas viena ar otru, tāpēc kultūrai augot veidojas audi, nevis atsevišķas šūnas. Šūnu kultūrā no vienas šūnas var izaudzēt veselu pieaugušu augu, piemēram, burkānu.
Mikrofigūras metode
Izmantojot mikromanipulatoru, atsevišķas šūnas daļas var noņemt, pievienot vai kaut kādā veidā modificēt. Lielu amēbas šūnu var iedalīt trīs galvenajos komponentos – šūnas membrānā, citoplazmā un kodolā, un pēc tam šīs sastāvdaļas var atkal salikt, veidojot dzīvu šūnu. Tādā veidā var iegūt mākslīgas šūnas, kas sastāv no dažāda veida amēbu sastāvdaļām.
Ja ņemam vērā, ka šķiet iespējams mākslīgi sintezēt dažus šūnu komponentus, tad mākslīgo šūnu montāžas eksperimenti var būt pirmais solis ceļā uz jaunu dzīvības formu radīšanu laboratorijā. Tā kā katrs organisms attīstās no vienas šūnas, mākslīgo šūnu ražošanas metode principā ļauj konstruēt noteikta veida organismus, ja tajā pašā laikā tiek izmantoti komponenti, kas nedaudz atšķiras no esošajām šūnām. Tomēr patiesībā nav nepieciešama visu šūnu komponentu pilnīga sintēze. Lielākās daļas, ja ne visu, šūnas sastāvdaļu struktūru nosaka nukleīnskābes. Tādējādi jaunu organismu radīšanas problēma ir saistīta ar jaunu nukleīnskābju veidu sintēzi un dabisko nukleīnskābju aizstāšanu noteiktās šūnās.
Šūnu saplūšanas metode
Cita veida mākslīgās šūnas var iegūt, sapludinot vienas vai dažādu sugu šūnas. Lai panāktu saplūšanu, šūnas tiek pakļautas vīrusu fermentiem; šajā gadījumā divu šūnu ārējās virsmas tiek salīmētas kopā, un starp tām esošā membrāna tiek iznīcināta, un veidojas šūna, kurā vienā kodolā ir ietverti divi hromosomu komplekti. Ir iespējams sakausēt dažāda veida šūnas vai dažādās dalīšanas stadijās. Izmantojot šo metodi, bija iespējams iegūt peles un vistas, cilvēka un peles un cilvēka un krupja hibrīdšūnas. Šādas šūnas ir hibrīdas tikai sākotnēji, un pēc daudzām šūnu dalīšanās tās zaudē lielāko daļu viena vai otra veida hromosomu. Galaprodukts, piemēram, kļūst par peles šūnu, kurā nav vai ir tikai neliels daudzums cilvēka gēnu. Īpaša interese ir normālu un ļaundabīgu šūnu saplūšana. Dažos gadījumos hibrīdi kļūst ļaundabīgi, citos nē, t.i. abas īpašības var izpausties gan kā dominējošas, gan recesīvas. Šis rezultāts nav negaidīts, jo ļaundabīgo audzēju var izraisīt dažādi faktori un tam ir sarežģīts mehānisms.
šūnu mikroskopijas gaisma
1.pielikums
2. attēls. Kriotoms 3. attēls. Fāzes kontrasta mikroskops
4. attēls. Interferences mikroskops
Ievietots vietnē Allbest.ru
...Līdzīgi dokumenti
Gaismas un elektronu mikroskopu uzbūves un darbības principu izpēte. Tumšā un gaišā lauka tehnikas, fāzes kontrasta mikroskopijas, traucējumu un polarizācijas apsvērumi. Vital fiksēto šūnu pētījums. Elektronu mikroskopijas pamati.
lekcija, pievienota 16.05.2014
Skenējošais tuneļa mikroskops, aplikācija. Atomu spēka mikroskopa darbības princips. Bioloģisko objektu - makromolekulu (t.sk. DNS molekulu), vīrusu un citu bioloģisko struktūru izpēte, izmantojot atomu spēka mikroskopiju.
kursa darbs, pievienots 28.04.2014
Elektronu mikroskopijas jēdziens kā metožu kopums ķermeņu mikrostruktūru un to lokālā sastāva pētīšanai, izmantojot elektronu mikroskopus. Televīzijas principa saturs skenēt plānu elektronu vai jonu kūli virs parauga virsmas.
prezentācija, pievienota 22.08.2015
Mazu priekšmetu izmēra mērīšana. Fāzes kontrasta metode. Elektronu optikas jēdziens. Elektronu mikroskopa izveide. Eksperimenti par elektronu difrakciju. Šūnu, vīrusu un citu mikroobjektu virsmas ģeometriskās struktūras izpēte.
prezentācija, pievienota 12.05.2017
Elektronu mikroskopiskās izpētes metode. Skenējošās elektronu mikroskopijas fiziskie pamati. Skenējošā elektronu mikroskopa shēma, tā sastāvdaļu mērķis un funkcionēšana. Objektu sagatavošana izpētei un īpašas prasības tiem.
kursa darbs, pievienots 05.04.2011
Optiskā spektra diapazons. Optisko NDT metožu teorētiskie pamati. Gaismas vibrācijas. Optisko NDT metožu klasifikācija. Diskrēts gāzu un šķidrumu emisijas spektrs. Cietvielu iekšējā starojuma nepārtraukts spektrs ar dažādām temperatūrām.
abstrakts, pievienots 15.01.2009
Preses kapilāru parametru mērīšanas metožu vispārīgie raksturojumi: hologrāfiskā interferometrija, Furjē optika, mikroskopiskā. Aplūkoto metožu salīdzinošā analīze, to galveno priekšrocību un trūkumu noteikšana.
tests, pievienots 20.05.2013
Atomu spēka mikroskopa izveide, darbības princips, priekšrocības un trūkumi. Atomu spēka mikroskopijas metodes. Atomu spēka mikroskopa tehniskās iespējas. Atomu spēka mikroskopijas pielietojums polimēru plēvju deformāciju aprakstīšanai.
kursa darbs, pievienots 14.11.2012
Mikroskopa vēsture - ierīce ar neapbruņotu aci neredzamu objektu palielinātu attēlu iegūšanai. Gaismas mikroskopijas metodes. Metalogrāfiskā mikroskopa darbības princips un uzbūve. Metālu mikroskopiskās izmeklēšanas metodes.
abstrakts, pievienots 06/10/2009
Skenējošās elektronu mikroskopijas pamati. Metālu kausējumu elektronmikroskopiskās izmeklēšanas metodiskās īpatnības. Mikroskopu īpašības, kas paredzētas metāla kausējumu virsmas slāņu struktūras izpētei.
E. Tumšā lauka mikroskopija.
18. Mikroskops sastāv no optiskām un mehāniskām daļām. Kas ir optiskās daļas?
A. Caurule, okulārs, kondensators
B. Revolveris, makro un mikroskrūve, spogulis
C. Revolveris, okulārs
D. Okulārs, kondensators, objektīvs
E. Caurule, okulārs, revolveris
19. Izmantojot ultravioletos starus kā gaismas avotu, palielinās mikroskopa izšķirtspēja. Kuras mikroskopiskās ierīces izmanto šo gaismas avotu?
A. Tumšs lauks un luminiscējoša
B. Luminiscējošs, ultravioletais
S. Viegls un elektronisks
D.Fāzes kontrasts, ultravioletais
E. Polarizējošs, ultravioletais
20. Mikroskops sastāv no mehāniskām un optiskām daļām. Kurām mikroskopa daļām ir diafragma?
A. Okulārs un objektīvs
B. Okulārs un kondensators
C. Caurule un okulārs
D. Lēca un kondensators
E. Caurule, lēca, okulārs
21. Eksperimentā tika izmantoti dzīvi objekti, kuros nepieciešams noteikt vairākas ķīmiskās sastāvdaļas, izmantojot vitālo novērojumu. Kāda mikroskopiskās izmeklēšanas metode tiks izmantota?
A. Fāzes kontrasta mikroskopija
B. Elektronu mikroskopija
C. Fluorescences mikroskopija
E Tumšā lauka mikroskopija.
22. Šūnu histoloģiskai izmeklēšanai tika izmantoti fosfori. Kāda veida mikroskopija tika izmantota šajā gadījumā?
A. Gaismas mikroskopija
B. Elektronu mikroskopija
C. Fluorescences mikroskopija
D. Polarizācijas mikroskopija
E. Tumšā lauka mikroskopija.
23. Pētniekam uzdots iegūt telpisku izpratni par pētāmā objekta struktūrām. Ar kādu mikroskopisko instrumentu speciālists strādās?
A. Ultravioletā mikroskopija,
B. Fāzes kontrasta mikroskopija,
C. Transmisijas elektronu mikroskopija,
D. Skenējošā elektronu mikroskopija,
E. Polarizācijas mikroskopija
24. Kā gaismas avotu izmanto dzīvsudraba-kvarca lampas. Kāda ir mikroskopa izšķirtspēja ar šo gaismas avotu?
25. Mikroskopa izšķirtspēja ir atkarīga no gaismas avota viļņa garuma. Kāda ir gaismas mikroskopa izšķirtspēja?
26. Pirms histoloģiskā parauga izmeklēšanas uzsākšanas nepieciešams vienmērīgi apgaismot redzes lauku. Kādas mikroskopa daļas tiek izmantotas šim nolūkam?
A. Mikro- un makrovit
B. Kondensators un spogulis
C. Caurule un caurules turētājs
D. Caurule un okulārs
27. Pētniekam tika uzdots izpētīt eritrocītu plazmlemmas ultramikroskopisko struktūru. Kāds mikroskopiskais instruments tiks izmantots?
A. Svetova
B. Fāzes kontrasts
C. Elektroniskā
D. Polarizācija
E. Ultravioletais
28. Pētot skeleta muskuļu audus, nepieciešams noteikt audu izo- un anizotropās struktūras. Kāda veida mikroskopija tiks izmantota?
A. Svetova
B. Fāzes kontrasts
C. Elektroniskā
D. Polarizācija
E. Ultramikroskopisks
29. Fluorescējošā mikroskopa izšķirtspēja ir atkarīga no gaismas avota viļņa garuma. Ar ko tas ir vienāds?
A. 0,1 µm C. 0,4 µm
B. 0,2 µm D. 0,1 nm
30. Klīniskajā laboratorijā mikroskopiskos izmeklējumus izmanto pilnīgas asins ainas izpētei. Kāds mikroskops tam vajadzīgs?
A. Svetovojs,
B. Fāzes kontrasts,
S. Electronic,
D. Polarizācija,
E. Ultravioletais.
31. Pētījumam tiek piedāvāts dzīvs objekts ar dabisku luminiscenci. Kāda veida mikroskopija jāizmanto šim pētījumam?
A. Svetova
B. Fāzes kontrasts
C. Elektroniskā
D. Polarizācija
E. Ultravioletais
32. Biopsijas rezultātā iegūts audzēja šūnu materiāls. Ir nepieciešams izpētīt to ultramikroskopisko struktūru. Kāda veida mikroskopija tiek izmantota šajā pētījumā?
A. Svetova
B. Fāzes kontrasts
C. Elektroniskā
D. Polarizācija
E. Ultravioletais
2. TĒMA: HISTOLOĢISKĀ TEHNIKA
Gaismas un elektronu mikroskopijas preparātu sagatavošanas pamatprincipi, materiāla ņemšana (biopsija, adatas punkcijas biopsija, autopsija). Objektu fiksācija, dehidratācija, blīvēšana, griezumu sagatavošana uz mikrotomiem un ultramikrotomiem. Mikropreparātu veidi - sekcija, uztriepe, nospiedums, plēve, plānā daļa. Preparāti krāsošanai un kontrastēšanai. Histoloģisko krāsvielu jēdziens.
Mikroskopiskā tehnika.
Galvenie citoloģiskās un histoloģiskās analīzes posmi:
Izpētes objekta izvēle
Sagatavošana pārbaudei mikroskopā
Mikroskopijas metožu pielietojums
Iegūto attēlu kvalitatīvā un kvantitatīvā analīze
Histoloģiskajā tehnoloģijā izmantotās metodes:
1. Visu mūžu.
2. Pēcnāves.
I INTERVITUĀLĀS METODES
Intravitālās izpētes mērķis ir iegūt informāciju par šūnas dzīvi: kustību, dalīšanos, augšanu, diferenciāciju, šūnu mijiedarbību, dzīves ilgumu, destrukciju, reaktīvām izmaiņām dažādu faktoru ietekmē.
Dzīvo šūnu un audu izpēte ir iespējama ārpus ķermeņa (in vitro) vai ķermeņa iekšienē (in vivo).
A. Dzīvu šūnu un audu izpēte kultūrā (in vitro) –
Audzēšanas metode
Ir: a) suspensijas kultūras (barības barotnē suspendētas šūnas), b) audi, c) orgāns, d) vienslānis.
Visizplatītākā ir audu kultivēšanas metode ārpus ķermeņa. Audus var kultivēt īpašās caurspīdīgās hermētiski noslēgtās kamerās. Sterilos apstākļos kamerā ievieto barotnes pilienu. Labākā uzturvielu barotne ir asins plazma, kurai pievieno embriju ekstraktu (ekstrakts no embrija audiem, kas satur lielu daudzumu vielu, kas stimulē augšanu). Tur novieto arī kultivējamu orgāna vai audu gabalu (ne vairāk kā 1 mm3).
Kultivētie audi jāuztur tā organisma ķermeņa temperatūrā, kura audi ņemti pētniecībai. Tā kā uzturvielu barotne ātri kļūst nelietojama (tajā uzkrājas kultivēto audu izdalītie sadalīšanās produkti), tā jāmaina ik pēc 3-5 dienām.
Kultivēšanas metodes izmantošana ļāva identificēt vairākus diferenciācijas modeļus, šūnu ļaundabīgu deģenerāciju, šūnu mijiedarbību savā starpā, kā arī ar vīrusiem un mikrobiem. Embrionālo audu kultivēšana ļāva pētīt kaulu, skrimšļu, ādas u.c. attīstību.
Kultivēšanas metodei ir īpaša nozīme, veicot eksperimentālus novērojumus ar cilvēka šūnām un audiem, jo īpaši, lai noteiktu dzimumu, ļaundabīgu deģenerāciju, iedzimtas slimības utt.
Metodes trūkumi:
1. Šīs metodes galvenais trūkums ir tas, ka audi vai orgāns tiek izmeklēti izolēti no ķermeņa. Neizjūtot ķermeņa neirohumorālo ietekmi, tas zaudē tai raksturīgo diferenciāciju.
2. Nepieciešamība pēc biežas transplantācijas (ar ilgstošu audzēšanu).
3. Identisks audu refrakcijas indekss.
Saistītā informācija.
Polarizācijas mikroskopija- viena no ļoti efektīvām morfoloģiskās izpētes metodēm, kurai ir plašas bioloģisko struktūru identificēšanas iespējas, kas apvienojumā ar pieejamību un relatīvo vienkāršību nosaka tās augsto vērtību. Metode ļauj izpētīt ne tikai zāļu histoloģisko struktūru, bet arī dažus tās histoķīmiskos parametrus. XX gadsimta 40. un 50. gados. polarizācijas mikroskopija tika uzskatīta par ultrastrukturālu metodi, jo tā ļāva redzēt audu ultrastrukturālās spējas.
Polarizācijas mikroskopija ir paredzēta, lai pētītu histoloģisko struktūru īpašības, kurām ir divkāršās laušanas (anizotropijas) spēja - gaismas stara sadalīšana, izejot cauri anizotropai videi. Gaismas vilnis anizotropā vidē sadalās divos viļņos ar savstarpēji perpendikulārām elektromagnētisko viļņu svārstību plaknēm. Šīs plaknes sauc par polarizācijas plaknēm. Polarizētā gaisma atšķiras no parastās (nepolarizētās) gaismas ar to, ka pēdējā gaismas viļņi svārstās dažādās plaknēs, savukārt polarizētajā gaismā tie notiek tikai noteiktā plaknē.
Lai radītu polarizācijas efektu, polarizējošais mikroskops izmanto divus polaroīdus. Pirmais, ko sauc par polarizatoru, ir novietots starp mikroskopa apgaismotāju un histoloģisko paraugu, bet otrs polaroīds, kas atrodas starp histoloģisko paraugu un pētnieka aci, ir analizators. Gan polarizators, gan analizators ir optiski tieši tādi paši polarizācijas filtri, tāpēc tos var nomainīt (ja mikroskopa dizains to atļauj). Iepriekš polarizācijas mikroskopijai tika izmantotas no Islandes špaga izgatavotas Nicolas, Arens vai Thomson prizmas. Šīm prizmām bija ierobežots gaismas laušanas leņķis. Pašlaik to vietā tiek izmantoti plakanie polarizācijas filtri, kas rada plaša lauka polarizētu gaismu.
Polarizētas gaismas veidošanā noteicošā loma ir polarizatora un analizatora relatīvajam novietojumam attiecībā pret mikroskopa optisko asi. Ja tie ir orientēti tā, lai abi polarizēto gaismu raidītu vienā plaknē, t.i. kad to polarizācijas plaknes sakrīt, abi polarizācijas filtri spēj pārraidīt polarizētu gaismu; mikroskopa redzes lauks ir spilgts (1.a att.).
Rīsi. 1 cilvēka plaušu gaišā lauka paraugs, OlympusCX41, 10x objektīvs
Ja polarizācijas filtru polarizācijas plaknes ir savstarpēji perpendikulāras (to panāk, analizatoru pagriežot par 90° ap mikroskopa optisko asi), tad polarizētā gaisma cauri neiziet un pētnieks redz tumšu redzes lauku (att. 2).
Kad polarizators tiek pagriezts par 360°, kad tas griežas, redzes lauks tiek pilnībā aptumšots divreiz un pilnībā izgaismots divreiz. Agrāk tika izmantoti kompensējošie Bernauera filtri, kas tumšajā redzes laukā rada sarkanīgu nokrāsu ( U-TP530 ). Lietojot melnus spoguļu filtrus, aptumšotais skata lauks nešķiet pilnīgi tumšs, bet gan vāji izgaismots.
2. attēls. Cilvēka plaušu paraugs polarizētā gaismā, 10x objektīvs
Gadījumos, kad polarizējošo filtru krustojuma stāvoklī (t.i., ortoskopijā) polarizētās gaismas ceļā tiek sastaptas histoloģiskā paraugā esošās anizotropās vielas, šīs vielas sadala polarizēto gaismu divos staros ar savstarpēji perpendikulārām gaismas svārstību plaknēm. viļņi. Gaismas stari, kuru vibrācijas plakne sakrīt ar polarizācijas plakni, iziet cauri analizatoram, un tie, kuru plakne ir perpendikulāra, tiek nogriezti, kā rezultātā gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī un uz kameru, ir tikai puse. sākotnējā gaismas stara intensitāte. Aprakstīto procesu rezultātā anizotropās vielas, kas atrodas starp diviem krustojošiem polarizatoriem, ir redzamas uz tumša fona gaišu gaismas objektu veidā. Tajā pašā laikā izotropās struktūras, kurām nav divkāršās laušanas spējas, paliek tumšas.
Tas arī ietekmē izvēli polarizācijas mikroskopijas kameras. Tā kā uzdevums ir tvert mazus spilgtus signālus uz tumša fona, parasti ar kameru spilgta lauka mikroskopijai var nepietikt kameras zemās jutības un lielā trokšņa daudzuma dēļ, kas rodas ierakstīšanas laikā. Polarizācijas mikroskopijai Nepieciešama mikroskopijas kamera ar augstu jutību un precīzu krāsu atveidi. Vēlams izmantot kameras, kuru pamatā ir CCD matricas (, VZ-CC50S), tomēr pašreizējā posmā varat izmantot arī kameru budžeta versijas, kuru pamatā ir Sony IMX sērijas CMOS matricas ().
Bioloģiskie audi satur pietiekamu skaitu anizotropu struktūru: muskuļu kontraktilās aparāta elementus, amiloīdu, urīnskābi, kolagēna veidojumus, dažus lipīdus, vairākus kristālus utt.
Gaismas stariem, kas sadalās anizotropā objektā un iet cauri analizatoram, ir raksturīgi nevienlīdzīgi viļņu izplatīšanās ātrumi. Atkarībā no šīs atšķirības lieluma (to sauc arī gaismas stara aizkaves vērtība) un gaismas absorbcijas atšķirību dēļ analizatorā anizotropo objektu mirdzums var būt balts vai krāsains. Pēdējā gadījumā mēs runājam par dihroisma fenomenu ( dubultā absorbcija I). Pētot polarizētā laukā, krāsu efektus rada, piemēram, daudzi kristāli.
Divkāršās laušanas procesu var pastiprināt, izmantojot noteiktas krāsvielas, kuru molekulas spēj orientēti nogulsnēties uz anizotropām struktūrām. Histoķīmiskās reakcijas, kuru rezultātā rodas anizotropijas efekts, sauc par topooptiskām reakcijām (G. Romhani). Ir divu veidu šādas reakcijas – aditīvās un apgrieztās. Ar aditīvām reakcijām palielinās gaismas stara aizkave, ko sauc par pozitīvo anizotropiju, ar apgrieztām reakcijām tā samazinās - negatīva anizotropija.
APARATŪRA UN IEKĀRTAS
Polarizācijas mikroskopija tiek veikta, izmantojot īpašus polarizācijas mikroskopus. Kā piemēru varam nosaukt importētos mikroskopus. Lielākā daļa mūsdienu optisko mikroskopu ir aprīkoti ar piederumiem polarizācijas mikroskopijai.
Polarizācijas mikroskopijai var izmantot jebkuru laboratorijas vai pētniecības klases gaismas mikroskopu. Pietiek ar diviem polarizācijas filtriem, no kuriem viens, kas darbojas kā polarizators, atrodas starp gaismas avotu un paraugu, bet otrs, kas pilda analizatora lomu, atrodas starp paraugu un pētnieka aci. Polarizatoru var iebūvēt kondensatorā vai novietot zem tā virs lauka diafragmas, un analizatoru var ievietot revolvera spraugā vai starpposma ieliktnī.
Attēlā 3. attēlā parādīta polarizējošā mikroskopa shematiska diagramma. Papildus komponentiem, kas ir kopīgi visiem gaismas mikroskopiem, polarizējošajam mikroskopam ir divi polarizācijas filtri (polarizators, kas parasti atrodas zem kondensatora, un analizators, kas atrodas okulārā), kā arī kompensators. Analizatoram ir jāgriežas, un, lai noteiktu rotācijas pakāpi, ir nepieciešama atbilstoša graduēta skala.
Polarizējošais mikroskops izmanto apgaismojuma avotu, kas nodrošina augstu gaismas stara blīvumu. Kā šādu avotu ieteicams izmantot 100 W lampu ar spriegumu 12 V. Dažiem pētījumu veidiem ir nepieciešama monohromatiska gaisma. Šim nolūkam tiek izmantots metāla traucējumu filtrs, kuru vislabāk novietot virs spoguļa. Pirms polarizatora novieto gaismu izkliedējošu matētu stiklu, t.i. starp to un gaismas avotu, bet nekādā gadījumā pēc polarizatora, jo tas izjauks polarizējošā filtra darbību.
Agrāk polarizācijas mikroskopijā izmantoja ahromatiskus objektīvus bez iekšējas spriedzes, taču tagad tie ir reti sastopami. Mūsdienās polarizējošajos mikroskopos tiek izmantoti tikai plāna ahromatiskie objektīvi, kuriem nav iekšējas spriedzes. Apohromatiskās lēcas var izmantot tikai gadījumos, kad mikrofotografēšanas laikā nepieciešama normāla krāsu atveide.
Polarizējošie mikroskopi ir aprīkoti ar rotējošu stadiju, kuras novietojums attiecībā pret optisko asi ir maināms. Galda griešanās leņķi mēra, izmantojot grādu skalu, kas atzīmēta gar tā apkārtmēru. Viens no priekšnoteikumiem efektīvai polarizācijas mikroskopijas izmantošanai ir rūpīga rotējošās pakāpes izlīdzināšana, izmantojot centrēšanas skrūves.
Svarīgs polarizējošā mikroskopa elements ir kompensators, kas atrodas starp objektīvu un analizatoru, parasti mikroskopa caurulē. Kompensators ir plāksne, kas izgatavota no īpaša veida ģipša, kvarca vai vizlas. Tas ļauj izmērīt atšķirību sadalīto gaismas staru ceļā, kas izteikts nanometros. Kompensatora darbību nodrošina tā spēja mainīt gaismas staru ceļa starpību, samazinot to līdz nullei vai palielinot līdz maksimumam. To panāk, pagriežot kompensatoru ap optisko asi.
MIKROSKOPIJAS TEHNIKA POLARIZĒTĀ GAISMĀ
Polarizācijas mikroskopiju ir ērtāk veikt aptumšotā telpā, jo gaismas plūsmas intensitāte, kas nonāk pētnieka acī, tiek samazināta 2 reizes, salīdzinot ar sākotnējo. Pēc mikroskopa apgaismotāja ieslēgšanas vispirms panākiet pēc iespējas spilgtāku redzes lauka apgaismojumu, pagriežot polarizatoru vai analizatoru. Šis polarizācijas filtru novietojums atbilst to polarizācijas plakņu sakritībai. Zāles tiek novietotas uz skatuves un vispirms tiek pētītas gaišā laukā. Pēc tam, pagriežot polarizatoru (vai analizatoru), redzes lauks tiek pēc iespējas tumšāks; šī filtra pozīcija atbilst polarizācijas plakņu perpendikulārajam izvietojumam. Lai atklātu anizotropijas efektu, ir nepieciešams apvienot anizotropā objekta polarizācijas plakni ar polarizētās gaismas plakni. Empīriski tas tiek panākts, pagriežot objekta stadiju ap optisko asi. Ja polarizācijas mikroskopijai izmanto gaismas mikroskopu, kas nav aprīkots ar rotējošu stadiju, tad histoloģiskais paraugs ir jāpagriež manuāli. Tas ir pieņemami, taču šajā gadījumā nav iespējams veikt noteikta veida polarizācijas mikroskopiju, kam nepieciešams kvantitatīvs novērtējums (nosakot divkāršās laušanas zīmi, gaismas staru ceļa atšķirības lielumu).
Ja anizotropie objekti testa paraugā ir sakārtoti (piemēram, šķērssvītrotu muskuļu šķiedru anizotropie diski), ir ērti tos pētīt fiksētā skatuves pozīcijā, kurā šie objekti dod maksimālu luminiscenci uz tumša fona. . Ja preparātā haotiski atrodas anizotropās struktūras (piemēram, kristāli), tad tos pētot ir nepārtraukti jāgroza skatuve, lai panāktu vienas vai otras objektu grupas mirdzumu.
Lai veiktu padziļinātu topooptisko reakciju analīzi un novērtēšanu, ir jāzina divkāršās laušanas relatīvās zīmes, staru ceļa starpības lieluma un starojuma indeksa (koeficienta) noteikšanas metodika. refrakcija.
Divkāršās laušanas zīme raksturo caur analizatoru ejošo gaismas staru ceļa pārvietošanās pakāpi un virzienu. Šo nobīdi izraisa topooptiskās krāsvielas, un, ja tā ir vērsta uz staru ceļa atšķirības samazināšanu, tās runā par negatīvu divkāršās laušanas pazīmi ( negatīva anizotropija), ja tas palīdz palielināt staru ceļa atšķirību, tad tiek konstatēta pozitīva dubultlaušanas pazīme ( pozitīva anizotropija). Ja staru ceļa atšķirība pazūd, tad anizotropijas efekts tiek izlīdzināts.
Divkāršās laušanas zīmi nosaka, izmantojot kompensatoru. Tās lietošanas procedūra ir šāda. Pētāmais objekts ir novietots tādā stāvoklī, kurā tiek sasniegta maksimālā anizotropo struktūru luminiscence tumšā redzes laukā. RI kompensatora plāksne tiek pagriezta ap optisko asi +45° leņķī attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni. Objekts, atkarībā no gaismas staru ceļa atšķirības, kas var svārstīties no 20 līdz 200 nm, iegūst vai nu zilu vai dzeltenu krāsu. Pirmajā gadījumā divkāršās lūzuma pazīme ir pozitīva, otrajā - negatīva. Jāpatur prātā, ka gadījumā, ja kompensators atrodas +45° leņķī, kopējais aptumšotā redzes lauka fons ir sarkanā nokrāsa.
Var izmantot arī λ/4 kompensatoru (U-TP137). Tā lietošanas procedūra ir tāda pati, tikai redzes laukam ir pelēks nokrāsa, nevis sarkans, un objekts spīd ar pozitīvu refrakcijas zīmi un ir aptumšots ar negatīvu zīmi.
Gaismas staru ceļa atšķirības kvantitatīvā noteikšana, kas izteikta nanometros, tiek veikta, izmantojot Braque Köhler kompensatoru. Lai to izdarītu, izmantojiet formulu:
Γ=Γλ×sinφ
kur λ ir konstante, ko ražotājs atzīmējis uz kompensatora, φ ir kompensatora griešanās leņķis attiecībā pret analizatora polarizācijas plakni.
Anizotropa objekta refrakcijas indeksu nosaka, salīdzinot to (zem mikroskopa) ar blakus novietotu testa objektu. Kā testa objekti tiek izmantoti standarta šķidrumi ar zināmu refrakcijas koeficientu. Priekšmets un paraugs uz skatuves novietoti blakus. Ja to refrakcijas rādītāji nesakrīt, starp objektu un paraugu ir redzama gaiša līnija, ko sauc par Beka līniju. Mikroskopa caurules pacelšana attiecībā pret fokusēto pozīciju izraisa Beka līnijas nobīdi pret vidi, kas dod izteiktāku refrakcijas efektu. Kad objekta un parauga refrakcijas rādītāji sakrīt, Beka līnija pazūd. Parasti refrakcijas indeksu nosaka monohromatiskā gaismā spektra nātrija līnijai (pie viļņa garuma 589 nm un temperatūrā 20 ° C). Refrakcija jānosaka divām savstarpēji perpendikulārām polarizācijas plaknēm. Šim nolūkam analizators tiek noņemts un objekta refrakcija tiek reģistrēta abās savstarpēji perpendikulārajās pozīcijās. Atšķirība starp abiem refrakcijas rādītājiem (ng - nk) raksturo laušanas spēku.
MATERIĀLU APSTRĀDES UN PREPARĀTU SAGATAVOŠANAS ĪPAŠĪBAS
Fiksācijas materiāls polarizācijas mikroskopijai skābā formalīnā nav vēlams, jo formalīna pigmentam, kas veidojas audu hemoglobīna mijiedarbībā ar skābo formaldehīdu, ir anizotropas īpašības un tas apgrūtina preparātu izpēti polarizētā gaismā. G. Scheuner un J. Hutschenreiter (1972) iesaka šim nolūkam izmantot 10% neitrālu formalīnu, Beikera kalcija-formola šķīdumu un Carnoy šķidrumu.
Fiksācijas ilgums 10% neitrālā formalīnā 4 °C temperatūrā ir 24 - 72 stundas, Beikera kalcija-formola šķīdumā - 16 - 24 stundas 4 °C temperatūrā. Fiksācija kalcija-formolā ir īpaši ieteicama, pētot lipīdu-olbaltumvielu savienojumus. Carnoy šķidrums ātri piesātina audumus. Gabalus ar biezumu 1 - 2 mm var profilēt jau pēc 1 stundas 4 °C temperatūrā. Fiksācija Carnoy šķidrumā nav piemērota lipīdu pētījumiem. Turklāt tiek izmantots Zenker šķidrums, it īpaši, ja tas ir piesūcināts ar zelta un sudraba sāļiem. Pēc apstrādes ar Zenkera šķidruma un etiķskābes maisījumu sarkanās asins šūnas iegūst spēju veikt divkāršu lūzumu.
Pārbaudot blīvos audus (kaulus, zobus) polarizējošā mikroskopā, papildus skābes atkaļķošanai ir nepieciešama papildu apstrāde kolagēna šķiedru noņemšanai. Šim nolūkam šādu audu sekcijas vairākas minūtes vāra glicerīna un kālija hidroksīda maisījumā (10 ml glicerīna un 2 graudi kālija hidroksīda), līdz tās pilnībā izbalē, pēc tam rūpīgi notecina sārmu, sekciju mazgā ūdenī. un ar pinceti pārnes uz mikroskopa stadiju.
Polarizācijas mikroskopijai izmanto parafīna, saldētās un kriostata sekcijas. Nekrāsotas saldētas sekcijas pārbaudei polarizētā gaismā ir iestrādātas glicerīnā. Nefiksētas kriostata sekcijas ir piemērotas polarizācijas mikroskopiskai analīzei tūlīt pēc sagatavošanas. Tā kā šīs sekcijas ir ļoti jutīgas pret dažādu vides faktoru kaitīgo ietekmi, tās joprojām ir ieteicams nostiprināt 10% neitrālā formaldehīda vai kalcija-formola šķīdumā.
Polarizācijas mikroskopijas rezultātus ietekmē histoloģisko griezumu biezums. Pētot biezus posmus, tiek radīti apstākļi dažādu anizotropu struktūru superpozīcijai viena virs otras. Turklāt ar dažādu slāņu biezumu var mainīties pētāmo konstrukciju anizotropās īpašības, tāpēc ir ļoti svarīgi, īpaši salīdzinošajos pētījumos, nodrošināt nemainīgu šķēles biezumu. Ieteicamais maksimālais sekcijas biezums nedrīkst pārsniegt 10 µm.
Vēl viens obligāts nosacījums ir rūpīga sekciju atvaskošana, jo nenoņemtie parafīna atlikumi rada izteiktu anizotropijas efektu, apgrūtinot pētījumu. Parafīns īpaši ilgi saglabājas uz sarkanajām asins šūnām un šūnu kodoliem. Lai pilnībā noņemtu parafīnu no sekcijām, ieteicams veikt šādu apstrādi.
- Ksilols 30 min
- Alkohols 100% 5 min
- Metanola un hloroforma maisījums (1:1) 50 °C temperatūrā 24 stundas
- Alkohols 100% 5 min
- Alkohols 70% 10 min Ūdens
Jāpatur prātā arī tas, ka sekcijas, kas pakļautas polarizācijas mikroskopijai, nedrīkst nonākt saskarē ar fenoliem (piemēram, tās nedrīkst attīrīt karboliskajā ksilolā).
Sīkāku informāciju par polarizācijas mikroskopiju un kompensatoru izmantošanu var iegūt saitē (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Ja jums ir kādi jautājumi par polarizācijas mikroskopiju, lūdzu, sazinieties ar Mikroskopijas skolu.
No visām dažādajām mikroskopijas ierīcēm polarizējošie mikroskopi ir tehniski vissarežģītākie. Šāda uzmanība ierīces dizainam izgatavojamības ziņā ir saistīta ar nepieciešamību iegūt augstākās kvalitātes attēlus, kurus tieši ietekmē mikroskopa optisko un apgaismojuma daļu dizains. Galvenā mikroskopijas polarizācijas ierīču izmantošanas joma ir minerālu, kristālu, izdedžu, anizotropu priekšmetu, tekstilizstrādājumu un ugunsizturīgo izstrādājumu, kā arī citu materiālu, kam raksturīga divkāršā laušana, izpēte. Pēdējais princips tiek izmantots attēlu veidošanai mikroskopijas ierīcēs, kurās pētāmais paraugs tiek apstarots ar polarizējošiem stariem. Šajā gadījumā paraugu anizotropās īpašības parādās pēc staru kūļa virziena maiņas. Šiem nolūkiem polarizējošo mikroskopu konstrukcijā ir iekļauti lauka filtri, kas rotē dažādās plaknēs viens pret otru: analizators griežas par 180 grādiem, bet polarizators griežas par 360. Mikroskopijas ierīču galvenā iezīme polarizētā gaismā ir spēja vadīt ortoskopiskus un konoskopiskie pētījumi, kas nav pieejami ar lielāko daļu citu mikroskopu veidu.
Parauga izpēte zem polarizējošā mikroskopa sākas ar polarizatora uzstādīšanu mikroskopa apgaismojuma daļā zem kondensatora, blakus diafragmas diafragmai. Šajā gadījumā analizators atrodas starp okulāru un objektīvu - aiz pēdējā pa gaismas staru ceļu. Pareizi uzstādot šādu ierīci mikroskopijai, pēc filtra lauku šķērsošanas redzamais lauks būs vienmērīgi tumšs, veidojot tā saukto ekstinkcijas efektu. Pabeidzot ierīces iestatījumus, pētāmais paraugs tiek fiksēts uz skatuves un tiek pētīts. Polarizējošo mikroskopu tabulas ir centrētas attiecībā pret optisko asi un ir pagriežamas par 360 grādiem, un līdzīgās ierīcēs laboratorijas un pētniecības vajadzībām tiem ir arī nonija. Polarizējošo mikroskopu optika un apgaismojuma sistēma ir augstākās kvalitātes un tāda izgatavošanas precizitāte, kas ļauj iegūt pēc iespējas skaidrāku attēlu bez kropļojumiem. Bieži vien ierīču komplektā paraugu pētīšanai polarizētā gaismā ietilpst kompensators un Bertrāna objektīvs. Pirmais ļauj efektīvi izpētīt minerālu struktūru, un objektīvs ļauj palielināt un fokusēt novērošanas laukumu, kad pēc skatuves pagriešanas notiek attēla izmaiņas. Mūsdienās tirgū ir trīs galvenie šādu ierīču veidi mikroskopijai - jau minētie pētnieciskie un laboratorijas mikroskopi, kā arī darba polarizējošais mikroskops.