Mikroskop terpolarisasi. Visualisasi struktur intraseluler mikroorganisme menggunakan mikroskop cahaya. Metode mikroskop kontras fase
![Mikroskop terpolarisasi. Visualisasi struktur intraseluler mikroorganisme menggunakan mikroskop cahaya. Metode mikroskop kontras fase](https://i0.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/211.jpg)
Mikroskop polarisasi memungkinkan Anda memperoleh gambar struktur anisotropik yang tidak ternoda (misalnya, serat kolagen, miofibril, atau sel mikroba). Prinsip metode ini didasarkan pada mempelajari suatu benda dalam cahaya yang dibentuk oleh dua berkas sinar yang terpolarisasi pada bidang yang saling tegak lurus.
Beras. 11-4. Diagram mikroskop fluoresensi.Mikroskop interferensi
Mikroskop interferensi menggabungkan prinsip-prinsip mikroskop fase kontras dan polarisasi. Metode tersebut digunakan untuk memperoleh gambar tiga dimensi yang kontras dari objek yang tidak dicat. Prinsip metode ini didasarkan pada pemisahan fluks cahaya di mikroskop; satu sinar melewati suatu benda, sinar lainnya melewatinya. Kedua sinar tersebut dihubungkan pada lensa okuler dan saling berinterferensi.
![](https://i0.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/211.jpg)
Mikroskop fluoresensi
Metode mikroskop fluoresensi berdasarkan kemampuan zat tertentu untuk bersinar ketika terkena radiasi gelombang pendek. Dalam hal ini, gelombang cahaya yang dipancarkan lebih panjang dibandingkan gelombang penyebab pendar. Dengan kata lain, benda berpendar menyerap cahaya dengan satu panjang gelombang dan memancarkan cahaya di wilayah spektrum lain (Gbr. 11-4). Misalnya, jika radiasi penginduksi berwarna biru, maka cahaya yang dihasilkan mungkin berwarna merah atau kuning. Zat-zat ini (fluorescein isocyanate, acridine orange, rhodamin, dll) digunakan sebagai pewarna fluoresen untuk mengamati objek berpendar (luminescent). Dalam mikroskop fluoresensi, cahaya dari suatu sumber (lampu merkuri bertekanan sangat tinggi) melewati dua filter.
![](https://i2.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/212.jpg)
Filter pertama (biru). memerangkap cahaya di depan sampel dan mentransmisikan cahaya dengan panjang gelombang yang merangsang fluoresensi sampel. Yang kedua (kuning) menghalangi cahaya biru, tetapi mentransmisikan cahaya kuning, merah, hijau yang dipancarkan oleh objek berpendar dan dilihat oleh mata. Biasanya mikroorganisme yang diteliti diwarnai secara langsung atau menggunakan AT atau lektin berlabel fluorokrom. Obat berinteraksi dengan Ag atau struktur pengikat ligan lainnya pada objek. Mikroskop fluoresensi telah menemukan aplikasi luas untuk memvisualisasikan hasil reaksi imunokimia berdasarkan interaksi spesifik AT yang diberi label pewarna fluoresen dengan Ag dari objek yang diteliti. Pilihan reaksi imunofluoresen disajikan pada Gambar. 11-5 dan 11-6.
Mengirimkan karya bagus Anda ke basis pengetahuan itu sederhana. Gunakan formulir di bawah ini
Pelajar, mahasiswa pascasarjana, ilmuwan muda yang menggunakan basis pengetahuan dalam studi dan pekerjaan mereka akan sangat berterima kasih kepada Anda.
Diposting pada http://www.allbest.ru/
Perkenalan
Mikroskop cahaya
Mikroskop elektron
Mikroskop polarisasi
Lampiran 1
Mikroskop cahaya
Mikroskop cahaya adalah metode paling kuno dan sekaligus salah satu metode paling umum untuk mempelajari dan mempelajari sel tumbuhan dan hewan. Diasumsikan bahwa awal mula studi sel justru dimulai dengan ditemukannya mikroskop optik cahaya. Ciri utama mikroskop cahaya adalah resolusi mikroskop cahaya yang ditentukan oleh panjang gelombang cahaya. Batas resolusi mikroskop cahaya ditentukan oleh panjang gelombang cahaya; mikroskop optik digunakan untuk mempelajari struktur yang memiliki dimensi minimal sama dengan panjang gelombang radiasi cahaya. Banyak sel penyusunnya memiliki kepadatan optik yang serupa dan memerlukan perlakuan awal sebelum dimikrokopi, jika tidak, sel-sel tersebut praktis tidak terlihat di bawah mikroskop cahaya konvensional. Untuk membuatnya terlihat, digunakan berbagai pewarna dengan selektivitas tertentu. Dengan menggunakan pewarna selektif, struktur internal sel dapat dipelajari secara lebih rinci.
Misalnya:
pewarna hematoksilin mewarnai beberapa komponen inti menjadi biru atau ungu;
setelah perawatan secara berurutan dengan phloroglucinol dan kemudian dengan asam klorida, membran sel lignifikasi menjadi merah ceri;
Pewarna Sudan III mewarnai membran sel suberisasi menjadi merah muda;
larutan lemah yodium dalam kalium iodida mengubah butiran pati menjadi biru.”
Saat melakukan pemeriksaan mikroskopis, sebagian besar jaringan difiksasi sebelum pewarnaan.
Setelah difiksasi, sel menjadi permeabel terhadap pewarna dan struktur sel menjadi stabil. Salah satu fiksatif yang paling umum dalam botani adalah etil alkohol.
Selama persiapan sediaan untuk mikrokopi, dibuat sayatan tipis pada mikrotom (Lampiran 1, Gambar 1). Alat ini menggunakan prinsip alat pengiris roti. Bagian yang sedikit lebih tebal dibuat untuk jaringan tumbuhan dibandingkan jaringan hewan karena sel tumbuhan relatif lebih besar. Ketebalan bagian jaringan tumbuhan sebesar - 10 mikron - 20 mikron. Beberapa jaringan terlalu lunak untuk langsung dipotong. Oleh karena itu, setelah fiksasi, mereka dituangkan ke dalam parafin cair atau resin khusus, yang memenuhi seluruh kain. Setelah dingin, terbentuk balok padat yang kemudian dipotong menggunakan mikrotom. Hal ini dijelaskan oleh fakta bahwa sel tumbuhan memiliki dinding sel yang kuat yang membentuk kerangka jaringan. Kerang yang mengalami lignifikasi sangat tahan lama.
Bila menggunakan isian pada saat persiapan, potongannya berisiko merusak struktur sel, untuk mencegahnya gunakan metode pembekuan cepat. Saat menggunakan metode ini, Anda dapat melakukannya tanpa memperbaiki dan mengisi. Jaringan beku dipotong menggunakan mikrotom khusus - cryotome (Lampiran 1, Gambar 2).
Bagian yang dibekukan lebih mempertahankan fitur struktural alami. Namun, memasaknya lebih sulit dan keberadaan kristal es merusak beberapa detailnya.
fase kontras (Lampiran 1, Gambar 3) dan mikroskop interferensi (Lampiran 1, Gambar 4) memungkinkan Anda memeriksa sel hidup di bawah mikroskop dengan manifestasi yang jelas dari detail strukturnya. Mikroskop ini menggunakan 2 berkas gelombang cahaya yang berinteraksi (superposisi) satu sama lain, menambah atau mengurangi amplitudo gelombang yang masuk ke mata dari berbagai komponen sel.
Mikroskop cahaya memiliki beberapa variasi.
Metode lapangan terang dan ragamnya
Metode medan cahaya yang ditransmisikan digunakan dalam studi sediaan transparan yang mengandung partikel dan detail penyerap cahaya (bagian tipis jaringan hewan dan tumbuhan berwarna, bagian tipis mineral). Dengan tidak adanya obat, seberkas cahaya dari kondensor, melewati lensa, menghasilkan bidang penerangan seragam di dekat bidang fokus lensa mata. Jika ada unsur penyerap dalam sediaan, terjadi penyerapan sebagian dan hamburan sebagian cahaya yang mengenainya, yang menyebabkan munculnya gambar. Metode ini juga dapat digunakan saat mengamati objek yang tidak menyerap, tetapi hanya jika objek tersebut menghamburkan sinar penerangan begitu kuat sehingga sebagian besar objek tersebut tidak mengenai lensa.
Metode pencahayaan miring- variasi dari metode sebelumnya. Perbedaan keduanya adalah cahaya diarahkan pada objek dengan sudut yang besar terhadap arah pengamatan. Terkadang hal ini membantu mengungkap “relief” suatu objek akibat terbentuknya bayangan.
Metode medan terang dalam cahaya yang dipantulkan digunakan saat mempelajari objek buram yang memantulkan cahaya, seperti bagian tipis logam atau bijih. Persiapan disinari (dari iluminator dan cermin tembus pandang) dari atas, melalui lensa, yang sekaligus berperan sebagai kondensor. Pada gambar yang dibuat pada bidang datar oleh lensa bersama dengan lensa tabung, struktur sediaan terlihat karena perbedaan reflektifitas elemen-elemennya; Di bidang terang, ketidakhomogenan yang menyebarkan cahaya yang mengenainya juga menonjol.
Metode medan gelap dan variasinya
Metode medan gelap terang yang ditransmisikan digunakan untuk memperoleh gambar objek transparan dan tidak menyerap yang tidak dapat dilihat dengan menggunakan metode medan terang. Seringkali ini adalah objek biologis. Cahaya dari iluminator dan cermin diarahkan ke preparasi oleh kondensor yang dirancang khusus - yang disebut. kondensor medan gelap. Saat keluar dari kondensor, bagian utama sinar cahaya yang tidak berubah arah ketika melewati sediaan transparan, membentuk berkas berbentuk kerucut berongga dan tidak masuk ke dalam lensa (yang terletak di dalam kerucut ini) . Bayangan pada mikroskop dibentuk hanya dengan menggunakan sebagian kecil sinar yang dihamburkan oleh mikropartikel obat yang terletak pada kaca objek ke dalam kerucut dan melewati lensa. Di bidang pandang dengan latar belakang gelap, gambar terang dari elemen struktural obat terlihat, yang berbeda dari lingkungan sekitar dalam indeks biasnya. Partikel besar hanya memiliki tepi terang yang menyebarkan sinar cahaya. Dengan menggunakan metode ini, tidak mungkin untuk menentukan dari tampilan gambar apakah partikel tersebut transparan atau buram, atau apakah partikel tersebut memiliki indeks bias yang lebih tinggi atau lebih rendah dibandingkan dengan medium di sekitarnya.
Mikroskop elektron
Mikroskop elektron pertama dibuat pada tahun 1931 oleh Knoll dan Ruska di Jerman. Baru pada tahun 50-an metode untuk menghasilkan bagian dengan kualitas yang diperlukan dikembangkan.
Kesulitan mikroskop elektron adalah pemrosesan sediaan khusus diperlukan untuk mempelajari sampel biologis.
Kesulitan pertama adalah elektron memiliki daya tembus yang sangat terbatas, sehingga bagian ultra tipis dengan ketebalan 50 - 100 nm harus disiapkan. Untuk mendapatkan bagian setipis itu, jaringan terlebih dahulu diresapi dengan resin: resin berpolimerisasi untuk membentuk balok plastik keras. Kemudian, dengan menggunakan pisau kaca atau berlian yang tajam, bagian-bagian tersebut dipotong pada mikrotom khusus.
Ada kesulitan lain: ketika elektron melewati jaringan biologis, gambar kontras tidak diperoleh. Untuk mendapatkan kontras, bagian tipis sampel biologis diresapi dengan garam logam berat.
Ada dua jenis utama mikroskop elektron. Dalam mikroskop transmisi (transmisi), seberkas elektron, melewati sampel yang disiapkan khusus, meninggalkan gambarnya di layar. Resolusi mikroskop elektron transmisi modern hampir 400 kali lebih besar dibandingkan resolusi cahaya. Mikroskop ini memiliki resolusi sekitar 0,5 nm.
Meskipun resolusinya tinggi, mikroskop elektron transmisi memiliki kelemahan utama:
Anda harus bekerja dengan material tetap;
gambar di layar berbentuk dua dimensi (datar);
Ketika diolah dengan logam berat, beberapa struktur seluler dihancurkan dan dimodifikasi.
Gambar tiga dimensi (volumetrik) diperoleh dengan menggunakan pemindaian mikroskop elektron (EM). Di sini sinar tidak melewati sampel, tetapi dipantulkan dari permukaannya.
Sampel uji difiksasi dan dikeringkan, setelah itu ditutup dengan lapisan logam tipis, suatu operasi yang disebut shading (sampel diarsir).
Dalam pemindaian EM, berkas elektron terfokus diarahkan ke sampel (sampel dipindai). Akibatnya, permukaan logam sampel memancarkan elektron sekunder berenergi rendah. Mereka direkam dan diubah menjadi gambar di layar televisi. Resolusi maksimum mikroskop pemindai kecil, sekitar 10 nm, tetapi gambarnya tiga dimensi.
Jenis mikroskop elektron:
Mikroskop elektron amplitudo- Metode mikroskop elektron amplitudo dapat digunakan untuk memproses gambar benda amorf dan benda lain (yang ukuran partikelnya lebih kecil dari jarak yang ditentukan dalam mikroskop elektron) yang menghamburkan elektron secara difusi. Dalam mikroskop elektron transmisi, misalnya, kontras gambar, yaitu perbedaan kecerahan gambar area tetangga objek, pada perkiraan pertama, sebanding dengan perbedaan ketebalan area tersebut.
Mikroskop elektron fase- Untuk menghitung kontras gambar benda kristal dengan struktur beraturan, serta untuk menyelesaikan masalah invers - menghitung struktur suatu objek dari gambar yang diamati - metode mikroskop elektron fase digunakan. Masalah difraksi gelombang elektron pada kisi kristal dipertimbangkan, solusinya juga memperhitungkan interaksi inelastis elektron dengan suatu benda: hamburan oleh plasma, fonon, dll. Dalam transmisi mikroskop elektron dan transmisi pemindaian resolusi tinggi mikroskop elektron, gambar molekul individu atau atom unsur berat diperoleh. Dengan menggunakan metode mikroskop elektron fase, dimungkinkan untuk merekonstruksi struktur tiga dimensi kristal dan makromolekul biologis dari gambar.
Mikroskop elektron kuantitatif- Metode mikroskop elektron kuantitatif adalah pengukuran yang tepat dari berbagai parameter sampel atau proses yang diteliti, misalnya pengukuran potensi listrik lokal, medan magnet, mikrogeometri relief permukaan, dll.
Mikroskop elektron Lorentz- Bidang kajian mikroskop elektron Lorentz yang mempelajari fenomena-fenomena yang disebabkan oleh gaya Lorentz adalah medan magnet dan listrik internal atau medan nyasar luar, misalnya bidang domain magnet pada film tipis, domain feroelektrik, bidang kepala. untuk perekaman informasi secara magnetis, dll.
Mikroskop polarisasi
Mikroskop polarisasi adalah metode observasi dalam cahaya terpolarisasi untuk pemeriksaan mikroskopis sediaan yang mengandung unsur anisotropik optik (atau seluruhnya terdiri dari unsur tersebut). Ini termasuk banyak mineral, butiran dalam bagian tipis paduan, beberapa jaringan hewan dan tumbuhan, dll. Pengamatan dapat dilakukan baik dalam cahaya yang ditransmisikan maupun dipantulkan. Cahaya yang dipancarkan iluminator dilewatkan melalui polarizer. Polarisasi yang diberikan padanya berubah seiring dengan lewatnya cahaya melalui sediaan (atau pantulan darinya). Perubahan ini dipelajari menggunakan penganalisis dan berbagai kompensator optik. Dengan menganalisis perubahan tersebut, seseorang dapat menilai karakteristik optik utama objek mikro anisotropik: kekuatan birefringence, jumlah sumbu optik dan orientasinya, rotasi bidang polarisasi, dan dichroism.
Metode kontras fase
metode fase kontras dan variasinya - yang disebut. metode kontras "anoptral". dirancang untuk memperoleh gambar objek transparan dan tidak berwarna yang tidak terlihat jika diamati menggunakan metode medan terang. Ini termasuk, misalnya, jaringan hewan hidup yang tidak diwarnai. Inti dari metode ini adalah bahwa bahkan dengan perbedaan yang sangat kecil dalam indeks bias dari berbagai elemen sediaan, gelombang cahaya yang melewatinya mengalami perubahan fase yang berbeda (memperoleh apa yang disebut fase relief). Tidak dirasakan secara langsung oleh mata atau pelat fotografi, perubahan fase ini diubah dengan bantuan perangkat optik khusus menjadi perubahan amplitudo gelombang cahaya, yaitu menjadi perubahan kecerahan (“amplitudo relief”), yaitu sudah terlihat oleh mata atau terekam pada lapisan fotosensitif. Dengan kata lain, pada gambar tampak yang dihasilkan, distribusi kecerahan (amplitudo) mereproduksi fase relief. Gambar yang diperoleh dengan cara ini disebut kontras fase.
Diagram operasi khas dari metode ini: diafragma bukaan dipasang di fokus depan kondensor, yang lubangnya berbentuk cincin. Gambarnya muncul di dekat fokus belakang lensa, dan disebut. pelat fase yang permukaannya terdapat tonjolan melingkar atau alur melingkar, disebut cincin fase. Pelat fase tidak selalu ditempatkan pada fokus lensa - sering kali cincin fase diterapkan langsung ke permukaan salah satu lensa objektif.
Bagaimanapun, sinar dari iluminator yang tidak dibelokkan dalam sediaan, sehingga memberikan gambaran diafragma, harus sepenuhnya melewati cincin fase, yang secara signifikan melemahkannya (dibuat menjadi menyerap) dan mengubah fasenya sebesar l/4 (l adalah panjang gelombang cahaya). Dan sinarnya, meskipun sedikit dibelokkan (tersebar) dalam sediaan, melewati pelat fase, melewati cincin fase, dan tidak mengalami pergeseran fase tambahan.
Dengan mempertimbangkan pergeseran fasa pada bahan preparasi, perbedaan fasa total antara berkas yang dibelokkan dan tidak dibelokkan mendekati 0 atau l/2, dan sebagai akibat dari interferensi cahaya pada bidang gambar dari preparasi, mereka secara nyata meningkatkan atau melemahkan satu sama lain, memberikan gambaran yang kontras tentang struktur sediaan. Sinar yang dibelokkan memiliki amplitudo yang jauh lebih rendah dibandingkan dengan sinar yang tidak menyimpang, oleh karena itu, melemahkan sinar utama di cincin fase, mendekatkan nilai amplitudo, juga menyebabkan kontras gambar yang lebih besar.
Metode ini memungkinkan untuk membedakan elemen struktur kecil yang kontrasnya sangat rendah dalam metode medan terang. Partikel transparan, yang ukurannya relatif kecil, menghamburkan sinar cahaya pada sudut yang sangat kecil sehingga sinar tersebut lewat bersama dengan sinar yang tidak dibelokkan melalui cincin fase. Untuk partikel seperti itu, efek kontras fase hanya terjadi di dekat konturnya, di mana terjadi hamburan yang kuat.
Metode observasi inframerah
metode pengamatan dalam inframerah Sinar (IR) juga memerlukan konversi gambar yang tidak terlihat oleh mata menjadi gambar yang terlihat menggunakan fotografi atau menggunakan konverter elektron-optik. Mikroskop IR memungkinkan untuk mempelajari struktur internal objek yang buram dalam cahaya tampak, seperti kacamata hitam, beberapa kristal dan mineral, dll.
Metode Pengamatan Ultraviolet
metode pengamatan pada sinar ultraviolet (UV). memungkinkan untuk meningkatkan resolusi maksimum mikroskop. Keuntungan utama dari metode ini adalah partikel dari banyak zat, transparan dalam cahaya tampak, menyerap radiasi UV dengan panjang gelombang tertentu dengan kuat dan oleh karena itu mudah dibedakan dalam gambar UV. Banyak zat yang terkandung dalam sel tumbuhan dan hewan (basa purin, basa pirimidin, sebagian besar vitamin, asam amino aromatik, beberapa lipid, tiroksin, dll.) memiliki karakteristik spektrum serapan di wilayah UV.
Karena sinar ultraviolet tidak terlihat oleh mata manusia, gambar dalam mikroskop UV direkam secara fotografis atau menggunakan konverter elektron-optik atau layar fluoresen. Obat tersebut difoto dalam tiga panjang gelombang spektrum UV. Masing-masing negatif yang dihasilkan diterangi dengan warna cahaya tampak tertentu (misalnya, biru, hijau, dan merah), dan semuanya diproyeksikan secara bersamaan ke satu layar. Hasilnya adalah gambaran warna suatu benda dengan warna konvensional, tergantung pada kapasitas penyerapan obat dalam sinar ultraviolet.
Mikrofotografi dan mikrosinema- ini adalah perolehan gambar pada lapisan fotosensitif menggunakan mikroskop. Metode ini banyak digunakan bersamaan dengan semua metode pemeriksaan mikroskopis lainnya. Untuk fotografi mikro dan mikrosinema, diperlukan beberapa restrukturisasi sistem optik mikroskop - berbeda dengan pengamatan visual terhadap pemfokusan lensa mata relatif terhadap gambar yang diberikan oleh lensa. Fotografi mikro diperlukan saat mendokumentasikan penelitian, saat mempelajari objek dalam sinar UV dan IR yang tidak terlihat oleh mata (lihat di atas), serta objek dengan intensitas pendaran rendah. Fotografi mikrofilm sangat diperlukan ketika mempelajari proses yang terjadi dari waktu ke waktu (aktivitas vital sel jaringan dan mikroorganisme, pertumbuhan kristal, terjadinya reaksi kimia sederhana, dll.).
Metode kontras interferensi
Metode kontras interferensi (mikroskop interferensi) terdiri dari pemisahan setiap berkas saat memasuki mikroskop. Salah satu sinar yang dihasilkan diarahkan melalui partikel yang diamati, yang lain melewatinya sepanjang cabang optik mikroskop yang sama atau tambahan. Pada bagian lensa okuler mikroskop, kedua berkas kembali dihubungkan dan saling berinterferensi. Kondensor dan lensa dilengkapi dengan pelat birefringent, yang pertama membagi berkas cahaya asli menjadi dua berkas, dan yang kedua menyatukannya kembali. Salah satu sinar, yang melewati suatu benda, mengalami penundaan fase (memperoleh perbedaan jalur dibandingkan dengan sinar kedua). Besarnya penundaan ini diukur dengan kompensator. Metode ini memungkinkan untuk mengamati objek transparan dan tidak berwarna, tetapi gambarnya juga bisa multi-warna (interferensi warna). Metode ini cocok untuk mempelajari jaringan dan sel hidup dan digunakan dalam banyak kasus untuk tujuan ini. Metode kontras interferensi sering digunakan bersama dengan metode mikroskop lainnya, khususnya pengamatan dalam cahaya terpolarisasi. Penggunaannya dalam kombinasi dengan mikroskop ultraviolet memungkinkan, misalnya, untuk menentukan kandungan asam nukleat dalam total massa kering suatu benda.
Metode penelitian dalam cahaya pendaran
metode studi dalam terang pendaran terdiri dari pengamatan di bawah mikroskop cahaya hijau-oranye dari objek mikro, yang terjadi ketika objek tersebut disinari dengan cahaya biru-ungu atau sinar ultraviolet yang tidak terlihat oleh mata. Dua filter cahaya dimasukkan ke dalam sirkuit optik mikroskop. Salah satunya ditempatkan di depan kondensor. Ini mentransmisikan radiasi dari sumber iluminator hanya pada panjang gelombang yang merangsang pendaran objek itu sendiri (pendaran intrinsik) atau pewarna khusus yang dimasukkan ke dalam sediaan dan diserap oleh partikelnya (pendaran sekunder). Filter kedua, yang dipasang setelah lensa, hanya mentransmisikan cahaya luminescent ke mata pengamat (atau ke lapisan fotosensitif). Mikroskop fluoresen menggunakan penerangan sediaan baik dari atas (melalui lensa, yang dalam hal ini juga berfungsi sebagai kondensor) maupun dari bawah, melalui kondensor biasa. Metode ini telah diterapkan secara luas dalam mikrobiologi, virologi, histologi, sitologi, dalam industri makanan, dalam penelitian tanah, dalam analisis mikrokimia, dan dalam deteksi cacat. Keragaman penerapan ini dijelaskan oleh sensitivitas warna mata yang sangat tinggi dan kontras yang tinggi dari gambar objek yang bercahaya sendiri pada latar belakang yang gelap dan tidak bercahaya.
Metode replika
Metode replika digunakan untuk mempelajari struktur geometris permukaan benda masif. Jejak diambil dari permukaan benda tersebut dalam bentuk lapisan tipis karbon, collodion, formvar, dll., mengulangi relief permukaan dan diperiksa dalam mikroskop elektron transmisi. Biasanya, pada sudut geser (kecil terhadap permukaan), lapisan logam berat yang menghamburkan elektron dengan kuat disemprotkan ke replika dalam ruang hampa, menutupi tonjolan dan cekungan relief geometris.
Metode dekorasi
Metode dekorasi tidak hanya mengkaji struktur geometris permukaan, tetapi juga medan mikro yang disebabkan oleh adanya dislokasi, akumulasi cacat titik, tahap pertumbuhan permukaan kristal, struktur domain, dll. Menurut metode ini, lapisan partikel penghias yang sangat tipis (Atom Au) pertama kali diendapkan pada permukaan sampel, Pt, dll., molekul semikonduktor atau dielektrik), diendapkan terutama di area di mana medan mikro terkonsentrasi, dan kemudian replika dengan penyertaan partikel penghias dihilangkan.
Untuk mendapatkan fraksi sel, berbagai jenis sentrifugasi banyak digunakan: sentrifugasi diferensial, sentrifugasi zonal, dan sentrifugasi gradien kepadatan kesetimbangan. Isu teoritis dan praktis terkait sentrifugasi dibahas secara komprehensif dalam ulasan Sykes.
Sentrifugasi diferensial
Dalam kasus sentrifugasi diferensial, sampel disentrifugasi selama waktu tertentu dengan kecepatan tertentu, setelah itu supernatan dihilangkan. Metode ini berguna untuk memisahkan partikel-partikel yang laju sedimentasinya sangat bervariasi. Misalnya, sentrifugasi selama 5-10 menit pada 3000-5000 hari menyebabkan sedimentasi sel bakteri utuh, sedangkan sebagian besar fragmen sel tetap berada dalam supernatan. Fragmen dinding sel dan struktur membran besar dapat dipelet dengan cara sentrifugasi pada 20.000-50.000 § selama 20 menit, sedangkan vesikel membran kecil dan ribosom memerlukan sentrifugasi pada 200.000 § selama 1 jam untuk menjadi pelet.
Sentrifugasi zona
Sentrifugasi zonal adalah metode efektif untuk memisahkan struktur yang memiliki kepadatan apung serupa tetapi berbeda dalam bentuk dan massa partikel. Contohnya termasuk pemisahan subunit ribosom, kelas polisom yang berbeda, dan molekul DNA dengan bentuk berbeda. Sentrifugasi dilakukan pada rotor bucket atau pada rotor zonal yang dirancang khusus; Untuk mencegah konveksi selama sentrifugasi, gradien lemah (biasanya sukrosa) dibuat di dalam gelas rotor ember atau di ruang rotor zonal. Sampel diterapkan dalam bentuk zona atau strip sempit di bagian paling atas kolom gradien. Untuk partikel subseluler, gradien sukrosa 15 hingga 40% (b/v) biasanya digunakan.
metode Laue
digunakan untuk kristal tunggal. Sampel diiradiasi dengan sinar dengan spektrum kontinu; orientasi timbal balik sinar dan kristal tidak berubah. Distribusi sudut radiasi terdifraksi berbentuk titik difraksi individu (Lauegram).
Metode Debye-Scherrer
Digunakan untuk mempelajari polikristal dan campurannya. Orientasi acak kristal dalam sampel relatif terhadap sinar datang monokromatik mengubah sinar terdifraksi menjadi rangkaian kerucut koaksial dengan sinar datang pada sumbunya. Gambaran mereka pada film fotografi (debyegram) berbentuk cincin konsentris, lokasi dan intensitasnya memungkinkan kita untuk menilai komposisi zat yang diteliti.
Metode kultur sel
Beberapa jaringan dapat dibagi menjadi sel-sel individual sehingga sel-sel tersebut tetap hidup dan seringkali mampu bereproduksi. Fakta ini secara definitif menegaskan gagasan sel sebagai suatu unit kehidupan. Spons, organisme multiseluler primitif, dapat dipisahkan menjadi sel-sel dengan menggosokkannya melalui saringan. Setelah beberapa waktu, sel-sel ini menyambung kembali dan membentuk spons. Jaringan embrio hewan dapat dibuat untuk berdisosiasi menggunakan enzim atau cara lain yang melemahkan ikatan antar sel.
Ahli embriologi Amerika R. Garrison (1879-1959) adalah orang pertama yang menunjukkan bahwa sel embrionik dan bahkan beberapa sel dewasa dapat tumbuh dan berkembang biak di luar tubuh dalam lingkungan yang sesuai. Teknik ini, yang disebut kultur sel, disempurnakan oleh ahli biologi Perancis A. Carrel (1873-1959). Sel tumbuhan juga dapat ditumbuhkan dalam kultur, namun dibandingkan dengan sel hewan, sel tersebut membentuk rumpun yang lebih besar dan melekat lebih kuat satu sama lain, sehingga jaringan terbentuk seiring pertumbuhan kultur, bukan sel individual. Dalam kultur sel, seluruh tanaman dewasa, seperti wortel, dapat ditumbuhkan dari satu sel.
Metode gambar mikro
Dengan menggunakan mikromanipulator, setiap bagian sel dapat dihilangkan, ditambah, atau dimodifikasi dengan cara tertentu. Sel amuba besar dapat dibagi menjadi tiga komponen utama – membran sel, sitoplasma dan nukleus, dan kemudian komponen-komponen ini dapat disusun kembali untuk membentuk sel hidup. Dengan cara ini, sel buatan yang terdiri dari komponen berbagai jenis amuba dapat diperoleh.
Mengingat bahwa beberapa komponen seluler dapat disintesis secara artifisial, maka eksperimen dalam merakit sel buatan mungkin merupakan langkah pertama menuju penciptaan bentuk kehidupan baru di laboratorium. Karena setiap organisme berkembang dari satu sel, metode pembuatan sel buatan pada prinsipnya memungkinkan pembuatan organisme dari jenis tertentu, jika pada saat yang sama menggunakan komponen yang sedikit berbeda dari yang ditemukan pada sel yang sudah ada. Namun kenyataannya, sintesis lengkap seluruh komponen seluler tidak diperlukan. Struktur sebagian besar, jika tidak seluruh, komponen sel ditentukan oleh asam nukleat. Dengan demikian, masalah penciptaan organisme baru bermuara pada sintesis asam nukleat jenis baru dan penggantiannya dengan asam nukleat alami dalam sel tertentu.
Metode fusi sel
Jenis sel buatan lainnya dapat diperoleh dengan menggabungkan sel dari spesies yang sama atau berbeda. Untuk mencapai fusi, sel-sel terkena enzim virus; dalam hal ini, permukaan luar dua sel direkatkan, dan membran di antara keduanya dihancurkan, dan sel terbentuk di mana dua set kromosom terbungkus dalam satu inti. Dimungkinkan untuk menggabungkan sel-sel dari jenis yang berbeda atau pada tahap pembelahan yang berbeda. Dengan menggunakan metode ini, dimungkinkan untuk memperoleh sel hibrida dari tikus dan ayam, manusia dan tikus, serta manusia dan katak. Sel-sel tersebut hanya bersifat hibrid pada awalnya, dan setelah banyak pembelahan sel, mereka kehilangan sebagian besar kromosom dari salah satu jenis atau jenis lainnya. Produk akhir, misalnya, pada dasarnya adalah sel tikus yang tidak memiliki atau hanya memiliki sedikit gen manusia. Yang menarik adalah perpaduan sel normal dan ganas. Dalam beberapa kasus, hibrida menjadi ganas, pada kasus lain tidak, yaitu. kedua sifat tersebut dapat memanifestasikan dirinya sebagai dominan dan resesif. Hal ini merupakan hal yang tidak terduga, karena keganasan dapat disebabkan oleh berbagai faktor dan memiliki mekanisme yang kompleks.
cahaya mikroskop sel
Lampiran 1
Gambar 2. Cryotome Gambar 3. Mikroskop fase kontras
Gambar 4. Mikroskop interferensi
Diposting di Allbest.ru
...Dokumen serupa
Studi tentang struktur dan prinsip pengoperasian mikroskop cahaya dan elektron. Pertimbangan teknik medan gelap dan terang, mikroskop fase kontras, interferensi dan polarisasi. Studi sel tetap yang penting. Dasar-dasar mikroskop elektron.
kuliah, ditambahkan 16/05/2014
Memindai mikroskop terowongan, aplikasi. Prinsip pengoperasian mikroskop gaya atom. Studi objek biologis - makromolekul (termasuk molekul DNA), virus dan struktur biologis lainnya menggunakan mikroskop kekuatan atom.
tugas kursus, ditambahkan 28/04/2014
Konsep mikroskop elektron sebagai seperangkat metode untuk mempelajari struktur mikro benda dan komposisi lokalnya menggunakan mikroskop elektron. Isi dari prinsip televisi memindai berkas tipis elektron atau ion di atas permukaan sampel.
presentasi, ditambahkan 22/08/2015
Mengukur ukuran benda kecil. Metode kontras fase. Konsep optik elektron. Penciptaan mikroskop elektron. Eksperimen difraksi elektron. Penelitian struktur geometris permukaan sel, virus dan benda mikro lainnya.
presentasi, ditambahkan 05/12/2017
Metode penelitian mikroskopis elektron. Dasar fisik pemindaian mikroskop elektron. Skema mikroskop elektron pemindai, tujuan komponen-komponennya dan fungsinya. Persiapan objek penelitian dan persyaratan khusus untuknya.
tugas kursus, ditambahkan 05/04/2011
Rentang spektrum optik. Landasan teori metode NDT optik. Getaran ringan. Klasifikasi metode NDT optik. Spektrum emisi gas dan cairan yang terpisah. Spektrum radiasi intrinsik zat padat yang kontinu dengan suhu berbeda.
abstrak, ditambahkan 15/01/2009
Karakteristik umum metode yang digunakan untuk mengukur parameter kapiler cetakan: interferometri holografik, optik Fourier, mikroskopis. Analisis komparatif dari metode yang dipertimbangkan, penentuan kelebihan dan kekurangan utamanya.
tes, ditambahkan 20/05/2013
Pembuatan mikroskop gaya atom, prinsip pengoperasian, kelebihan dan kekurangan. Metode mikroskop gaya atom. Kemampuan teknis mikroskop gaya atom. Penerapan mikroskop kekuatan atom untuk menggambarkan deformasi film polimer.
tugas kursus, ditambahkan 14/11/2012
Sejarah mikroskop - alat untuk memperoleh gambar yang diperbesar dari objek yang tidak terlihat dengan mata telanjang. Metode mikroskop cahaya. Prinsip operasi dan struktur mikroskop metalografi. Metode pemeriksaan mikroskopis logam.
abstrak, ditambahkan 06/10/2009
Dasar-dasar pemindaian mikroskop elektron. Fitur metodologis pemeriksaan mikroskopis elektron pada lelehan logam. Fitur mikroskop yang dirancang untuk mempelajari struktur lapisan permukaan lelehan logam.
E. Mikroskop medan gelap.
18. Mikroskop terdiri dari bagian optik dan mekanik. Apa bagian optiknya?
A. Tabung, lensa mata, kondensor
B. Revolver, sekrup makro dan mikro, cermin
C. Revolver, lensa mata
D. Lensa mata, kondensor, objektif
E. Tabung, lensa mata, pistol
19. Bila sinar ultraviolet digunakan sebagai sumber cahaya, resolusi mikroskop meningkat. Perangkat mikroskopis manakah yang menggunakan sumber cahaya ini?
A. Bidang gelap dan bercahaya
B. Berpendar, ultraviolet
S. Ringan dan elektronik
D. Fase kontras, ultraviolet
E. Polarisasi, ultraviolet
20. Mikroskop terdiri dari bagian mekanik dan optik. Bagian mikroskop manakah yang mempunyai diafragma?
A. Lensa mata dan objektif
B. Lensa mata dan kondensor
C. Tabung dan lensa mata
D. Lensa dan kondensor
E. Tabung, lensa, lensa mata
21. Percobaan menggunakan benda hidup yang memerlukan penentuan sejumlah komponen kimia dengan menggunakan pengamatan vital. Metode pemeriksaan mikroskopis apa yang akan digunakan?
A. Mikroskop kontras fase
B.Mikroskopi elektron
C. Mikroskop fluoresensi
E Mikroskop lapangan gelap.
22. Untuk pemeriksaan histologis sel, digunakan fosfor. Jenis mikroskop apa yang digunakan pada kasus ini?
A.Mikroskopi cahaya
B.Mikroskopi elektron
C. Mikroskop fluoresensi
D.Mikroskop polarisasi
E. Mikroskop medan gelap.
23. Peneliti bertugas memperoleh pemahaman spasial terhadap struktur objek yang diteliti. Instrumen mikroskopis apa yang akan digunakan oleh spesialis tersebut?
A.Mikroskopi ultraviolet,
B. Mikroskop kontras fase,
C. Mikroskop elektron transmisi,
D. Pemindaian mikroskop elektron,
E.Mikroskop polarisasi
24. Lampu merkuri-kuarsa digunakan sebagai sumber cahaya. Berapakah resolusi mikroskop dengan sumber cahaya tersebut?
25. Resolusi mikroskop bergantung pada panjang gelombang sumber cahaya. Berapa daya pisah mikroskop cahaya?
26. Sebelum memulai pemeriksaan spesimen histologis, bidang pandang perlu disinari secara merata. Bagian mikroskop apa yang digunakan untuk ini?
A. Mikro dan makrovit
B. Kondensor dan cermin
C. Tabung dan dudukan tabung
D. Tabung dan lensa mata
27. Peneliti bertugas mempelajari struktur ultramikroskopis plasmalemma eritrosit. Instrumen mikroskopis apa yang akan digunakan?
A.Svetova
B. Fase kontras
C.Elektronik
D.Polarisasi
E.Ultraviolet
28. Saat mempelajari jaringan otot rangka, perlu untuk menentukan struktur iso dan anisotropik jaringan. Jenis mikroskop apa yang akan digunakan?
A.Svetova
B. Fase kontras
C.Elektronik
D.Polarisasi
E. Ultramikroskopis
29. Resolusi mikroskop fluoresen bergantung pada panjang gelombang sumber cahaya. Sama dengan apa?
A. 0,1 µm C. 0,4 µm
B.0,2 µm D.0,1 nm
30. Di laboratorium klinis, pemeriksaan mikroskopis digunakan untuk mempelajari hitung darah lengkap. Mikroskop apa yang diperlukan untuk ini?
A.Svetovoy,
B. Fase kontras,
S.Elektronik,
D.Polarisasi,
E.Ultraviolet.
31. Sebuah benda hidup dengan pendaran alami disajikan untuk penelitian. Jenis mikroskop apa yang harus digunakan untuk penelitian ini?
A.Svetova
B. Fase kontras
C.Elektronik
D.Polarisasi
E.Ultraviolet
32. Dari hasil biopsi diperoleh bahan sel tumor. Penting untuk mempelajari struktur ultramikroskopisnya. Jenis mikroskop apa yang digunakan dalam penelitian ini?
A.Svetova
B. Fase kontras
C.Elektronik
D.Polarisasi
E.Ultraviolet
TOPIK 2: TEKNIK HISTOLOGI
Prinsip dasar penyiapan sediaan mikroskop cahaya dan elektron, pengambilan bahan (biopsi, biopsi tusukan jarum, otopsi). Fiksasi, dehidrasi, pemadatan benda, pembuatan bagian pada mikrotom dan ultramikrotom. Jenis sediaan mikro - sayatan, olesan, cetakan, film, sayatan tipis. Persiapan pewarnaan dan kontras. Konsep pewarna histologis.
Teknik mikroskopis.
Tahapan utama analisis sitologi dan histologis:
Memilih objek penelitian
Mempersiapkannya untuk diperiksa di bawah mikroskop
Penerapan metode mikroskop
Analisis kualitatif dan kuantitatif dari gambar yang diperoleh
Metode yang digunakan dalam teknologi histologis:
1. Seumur hidup.
2. Anumerta.
I METODE INTERVITUAL
Tujuan penelitian intravital adalah untuk memperoleh informasi tentang kehidupan sel: pergerakan, pembelahan, pertumbuhan, diferensiasi, interaksi sel, harapan hidup, penghancuran, perubahan reaktif di bawah pengaruh berbagai faktor.
Studi tentang sel dan jaringan hidup dapat dilakukan di luar tubuh (in vitro) atau di dalam tubuh (in vivo).
A. Studi tentang sel dan jaringan hidup dalam kultur (in vitro) –
Metode budidaya
Ada: a) kultur suspensi (sel tersuspensi dalam media nutrisi), b) jaringan, c) organ, d) monolayer.
Metode kultur jaringan di luar tubuh adalah yang paling umum. Jaringan dapat dibudidayakan di ruang khusus yang tertutup rapat dan transparan. Dalam kondisi steril, setetes media nutrisi ditempatkan ke dalam ruangan. Media nutrisi terbaik adalah plasma darah, yang ditambahkan ekstrak embrio (ekstrak dari jaringan embrio yang mengandung sejumlah besar zat yang merangsang pertumbuhan). Sepotong organ atau jaringan (tidak lebih dari 1 mm3) yang perlu dibiakkan juga ditempatkan di sana.
Jaringan yang dikultur harus dijaga pada suhu tubuh organisme yang jaringannya diambil untuk penelitian. Karena media nutrisi dengan cepat menjadi tidak dapat digunakan (produk dekomposisi yang dikeluarkan oleh jaringan kultur menumpuk di dalamnya), media tersebut perlu diganti setiap 3-5 hari.
Penggunaan metode budidaya memungkinkan untuk mengidentifikasi sejumlah pola diferensiasi, degenerasi sel ganas, interaksi sel satu sama lain, serta dengan virus dan mikroba. Budidaya jaringan embrio memungkinkan untuk mempelajari perkembangan tulang, tulang rawan, kulit, dll.
Metode budidaya sangat penting untuk melakukan pengamatan eksperimental pada sel dan jaringan manusia, khususnya untuk menentukan jenis kelamin, degenerasi ganas, penyakit keturunan, dll.
Kerugian dari metode ini:
1. Kerugian utama dari metode ini adalah pemeriksaan jaringan atau organ dilakukan secara terpisah dari tubuh. Tanpa mengalami pengaruh neurohumoral tubuh, ia kehilangan diferensiasi yang melekat.
2. Perlunya transplantasi yang sering (dengan budidaya jangka panjang).
3. Indeks bias jaringan yang identik.
Informasi terkait.
Mikroskop polarisasi- salah satu metode penelitian morfologi yang sangat efektif, yang memiliki kemampuan luas untuk mengidentifikasi struktur biologis, yang dikombinasikan dengan aksesibilitas dan kesederhanaan relatif, menentukan nilainya yang tinggi. Metode ini memungkinkan untuk mempelajari tidak hanya struktur histologis obat, tetapi juga beberapa parameter histokimianya. Pada tahun 40-an dan 50-an abad XX. mikroskop polarisasi dianggap sebagai metode ultrastruktural, karena memungkinkan untuk melihat kemampuan ultrastruktur jaringan.
Mikroskop polarisasi dirancang untuk mempelajari sifat-sifat struktur histologis yang memiliki kemampuan birefringence (anisotropi) - pemisahan berkas cahaya ketika melewati media anisotropik. Gelombang cahaya dalam medium anisotropik terpecah menjadi dua gelombang dengan bidang osilasi gelombang elektromagnetik yang saling tegak lurus. Bidang-bidang ini disebut bidang polarisasi. Cahaya terpolarisasi berbeda dari cahaya biasa (non-terpolarisasi) karena pada cahaya biasa gelombang cahaya berosilasi pada bidang yang berbeda, sedangkan pada cahaya terpolarisasi hanya terjadi pada bidang tertentu.
Untuk menciptakan efek polarisasi, mikroskop polarisasi menggunakan dua polaroid. Yang pertama disebut polarizer, ditempatkan di antara iluminator mikroskop dan spesimen histologis, sedangkan Polaroid kedua yang terletak di antara spesimen histologis dan mata peneliti adalah alat analisa. Baik polarizer maupun analisa secara optik merupakan filter polarisasi yang sama persis, sehingga keduanya dapat ditukar (jika desain mikroskop memungkinkan). Sebelumnya, prisma Nicolas, Arens atau Thomson yang terbuat dari tiang Islandia digunakan untuk mikroskop polarisasi. Prisma ini memiliki sudut pembiasan cahaya yang terbatas. Saat ini, filter polarisasi datar digunakan sebagai penggantinya, yang menghasilkan cahaya terpolarisasi medan luas.
Dalam menciptakan cahaya terpolarisasi, peran penentu dimainkan oleh posisi relatif polarizer dan penganalisis relatif terhadap sumbu optik mikroskop. Jika keduanya diorientasikan sedemikian rupa sehingga keduanya mentransmisikan cahaya terpolarisasi pada bidang yang sama, mis. ketika bidang polarisasinya bertepatan, kedua filter polarisasi mampu mentransmisikan cahaya terpolarisasi; bidang pandang mikroskop terang (Gbr. 1a).
Beras. 1 Spesimen Brightfield paru-paru manusia, OlympusCX41, lensa 10x
Jika bidang polarisasi filter polarisasi saling tegak lurus (hal ini dicapai dengan memutar penganalisis 90° mengelilingi sumbu optik mikroskop), maka cahaya terpolarisasi tidak melewatinya dan peneliti melihat bidang pandang gelap (Gbr. 2). 2).
Saat polarizer diputar 360° saat berputar, bidang pandang menjadi gelap sepenuhnya dua kali dan menjadi cerah sepenuhnya dua kali. Di masa lalu, filter kompensasi Bernauer telah digunakan, yang menghasilkan warna kemerahan pada bidang pandang gelap ( U-TP530 ). Saat filter cermin hitam digunakan, bidang pandang yang digelapkan tidak tampak gelap sepenuhnya, melainkan terang benderang.
Gambar 2 Spesimen paru-paru manusia dalam cahaya terpolarisasi, objektif 10x
Dalam kasus di mana, dengan posisi filter polarisasi yang bersilangan (yaitu dalam ortoskopi), zat anisotropik yang terkandung dalam spesimen histologis ditemui di jalur cahaya terpolarisasi, zat ini membagi cahaya terpolarisasi menjadi dua berkas dengan bidang osilasi cahaya yang saling tegak lurus. ombak. Sinar cahaya dengan bidang getaran yang bertepatan dengan bidang polarisasi melewati penganalisis, dan sinar cahaya yang bidang getarannya tegak lurus terputus, akibatnya intensitas fluks cahaya yang masuk ke mata peneliti dan ke kamera hanya setengahnya. intensitas berkas cahaya aslinya. Sebagai hasil dari proses yang dijelaskan, zat anisotropik yang terletak di antara dua polarizer bersilangan terlihat dengan latar belakang gelap dalam bentuk objek bercahaya terang. Pada saat yang sama, struktur isotropik yang tidak memiliki kemampuan birefringence tetap gelap.
Hal ini juga mempengaruhi pilihan kamera untuk mikroskop polarisasi. Karena tugasnya adalah menangkap sinyal terang kecil pada latar belakang gelap, biasanya kamera untuk mikroskop medan terang mungkin tidak cukup karena rendahnya sensitivitas kamera dan banyaknya noise yang dihasilkan selama perekaman. Untuk mikroskop polarisasi Diperlukan kamera mikroskop dengan sensitivitas tinggi dan reproduksi warna yang akurat. Lebih baik menggunakan kamera berdasarkan matriks CCD (, VZ-CC50S), namun, pada tahap saat ini, Anda juga dapat menggunakan kamera versi anggaran berdasarkan matriks CMOS seri Sony IMX ().
Jaringan biologis mengandung struktur anisotropik dalam jumlah yang cukup: elemen alat kontraktil otot, amiloid, asam urat, formasi kolagen, beberapa lipid, sejumlah kristal, dll.
Sinar cahaya yang dipecah dalam objek anisotropik dan melewati penganalisis dicirikan oleh kecepatan rambat gelombang yang tidak sama. Tergantung pada besarnya perbedaan ini (disebut juga nilai penundaan berkas cahaya) dan karena perbedaan penyerapan cahaya pada alat analisa, pancaran benda anisotropik bisa berwarna putih atau berwarna. Dalam kasus terakhir kita berbicara tentang fenomena dichroisme ( penyerapan ganda SAYA). Ketika dipelajari dalam bidang terpolarisasi, efek warna dihasilkan, misalnya, oleh banyak kristal.
Proses birefringence dapat ditingkatkan dengan penggunaan pewarna tertentu, yang molekulnya memiliki kemampuan untuk diendapkan secara berorientasi pada struktur anisotropik. Reaksi histokimia yang menghasilkan efek anisotropi disebut reaksi topo-optik (G. Romhanyi). Ada dua jenis reaksi tersebut - aditif dan invers. Dengan reaksi aditif, penundaan berkas cahaya meningkat, yang disebut anisotropi positif; dengan reaksi terbalik, penundaannya berkurang - anisotropi negatif.
PERANGKAT KERAS DAN PERALATAN
Mikroskop polarisasi dilakukan dengan menggunakan mikroskop polarisasi khusus. Sebagai contoh, kita dapat menyebutkan mikroskop yang diimpor. Kebanyakan mikroskop optik modern dilengkapi dengan aksesoris untuk mikroskop polarisasi.
Mikroskop cahaya tingkat laboratorium atau penelitian apa pun dapat digunakan untuk mikroskop polarisasi. Cukup memiliki dua filter polarisasi, salah satunya berfungsi sebagai polarizer, ditempatkan di antara sumber cahaya dan spesimen, dan yang lainnya, berperan sebagai penganalisis, ditempatkan di antara spesimen dan mata peneliti. Polarizer dapat dimasukkan ke dalam kondensor atau ditempatkan di bawahnya di atas diafragma lapangan, dan penganalisis dapat ditempatkan di slot di revolver atau di sisipan perantara.
Pada Gambar. Gambar 3 menunjukkan diagram skema mikroskop polarisasi. Selain komponen yang umum pada semua mikroskop cahaya, mikroskop polarisasi memiliki dua filter polarisasi (polarizer, biasanya terletak di bawah kondensor, dan penganalisis yang terletak di lensa mata), serta kompensator. Alat analisa harus berputar, dan skala skala yang sesuai diperlukan untuk menentukan derajat rotasi.
Mikroskop polarisasi menggunakan sumber penerangan yang menghasilkan berkas cahaya dengan kepadatan tinggi. Disarankan untuk menggunakan lampu 100 W dengan tegangan 12 V sebagai sumbernya.Untuk beberapa jenis penelitian diperlukan cahaya monokromatik. Untuk tujuan ini, filter interferensi logam digunakan, yang paling baik ditempatkan di atas cermin. Kaca buram yang menyebarkan cahaya ditempatkan di depan polarizer, mis. antara itu dan sumber cahaya, tetapi jangan setelah polarizer, karena ini akan mengganggu fungsi filter polarisasi.
Di masa lalu, obyektif akromatik tanpa ketegangan internal digunakan untuk mikroskop polarisasi, namun sekarang hal ini jarang terjadi. Saat ini, hanya objek akromatik rencana, yang tidak memiliki tegangan internal, yang digunakan dalam mikroskop polarisasi. Lensa apokromatik hanya dapat digunakan jika rendisi warna normal diperlukan selama fotografi mikro.
Mikroskop polarisasi dilengkapi dengan tahap berputar, yang posisinya relatif terhadap sumbu optik dapat diubah. Sudut putaran meja diukur dengan menggunakan skala derajat yang ditandai sepanjang kelilingnya. Salah satu prasyarat untuk penggunaan mikroskop polarisasi yang efektif adalah penyelarasan tahap putaran secara hati-hati menggunakan sekrup pemusatan.
Elemen penting dari mikroskop polarisasi adalah kompensator yang ditempatkan di antara objektif dan penganalisis, biasanya di dalam tabung mikroskop. Kompensator adalah pelat yang terbuat dari jenis khusus gipsum, kuarsa atau mika. Ini memungkinkan Anda mengukur perbedaan jalur sinar cahaya yang terbelah, dinyatakan dalam nanometer. Berfungsinya kompensator dipastikan dengan kemampuannya mengubah perbedaan jalur sinar cahaya, menguranginya menjadi nol atau meningkatkannya hingga maksimum. Hal ini dicapai dengan memutar kompensator di sekitar sumbu optik.
TEKNIK MIKROSKOP DALAM CAHAYA TERPOLARISASI
Lebih mudah melakukan mikroskop polarisasi di ruangan yang gelap, karena intensitas fluks cahaya yang masuk ke mata peneliti berkurang 2 kali lipat dibandingkan aslinya. Setelah menyalakan iluminator mikroskop, pertama-tama capailah iluminasi bidang pandang seterang mungkin dengan memutar polarizer atau penganalisis. Posisi filter polarisasi ini berhubungan dengan kebetulan bidang polarisasinya. Obat diletakkan di atas panggung dan dipelajari terlebih dahulu di lapangan terang. Kemudian, dengan memutar polarizer (atau analisa), bidang pandang digelapkan sebanyak mungkin; posisi filter ini sesuai dengan susunan tegak lurus bidang polarisasi. Untuk mengetahui pengaruh anisotropi, perlu menggabungkan bidang polarisasi suatu benda anisotropik dengan bidang cahaya terpolarisasi. Secara empiris, hal ini dicapai dengan memutar panggung objek di sekitar sumbu optik. Jika mikroskop cahaya yang tidak dilengkapi tahap berputar digunakan untuk mikroskop polarisasi, maka spesimen histologis harus diputar secara manual. Hal ini dapat diterima, tetapi dalam hal ini tidak mungkin untuk melakukan jenis mikroskop polarisasi tertentu yang memerlukan penilaian kuantitatif (menentukan tanda birefringence, besarnya perbedaan jalur sinar cahaya).
Jika objek anisotropik dalam benda uji disusun secara teratur (misalnya, cakram anisotropik serat otot lurik), akan lebih mudah untuk mempelajarinya dalam posisi panggung yang tetap, di mana objek ini memberikan pendaran maksimum pada latar belakang gelap. . Jika struktur anisotropik terletak secara kacau dalam sediaan (misalnya, kristal), maka ketika mempelajarinya, Anda harus terus-menerus memutar panggung untuk mencapai cahaya pada kelompok objek tertentu.
Untuk melakukan analisis dan evaluasi reaksi topo-optik lebih mendalam, perlu diketahui metodologi penentuan tanda relatif birefringence, besarnya selisih lintasan sinar dan indeks (koefisien) sinar. pembiasan.
Tanda birefringence mencirikan derajat dan arah perpindahan jalur sinar cahaya yang melewati alat analisa. Pergeseran ini disebabkan oleh pewarna topo-optik, dan jika diarahkan untuk mengurangi perbedaan jalur sinar, hal ini menunjukkan tanda negatif birefringence ( anisotropi negatif), jika membantu meningkatkan perbedaan jalur sinar, maka dinyatakan tanda positif birefringence ( anisotropi positif). Jika perbedaan jalur sinar menghilang, maka efek anisotropi menjadi rata.
Tanda birefringence ditentukan dengan menggunakan kompensator. Tata cara penggunaannya adalah sebagai berikut. Objek yang diteliti ditempatkan pada posisi di mana pendaran maksimum struktur anisotropik dicapai dalam bidang pandang gelap. Pelat kompensator RI diputar mengelilingi sumbu optik pada sudut +45° relatif terhadap bidang polarisasi alat analisa. Suatu objek, bergantung pada perbedaan jalur sinar cahaya, yang berkisar antara 20 hingga 200 nm, memperoleh warna biru atau kuning. Dalam kasus pertama, tanda birefringence adalah positif, yang kedua - negatif. Perlu diingat bahwa jika kompensator terletak pada sudut +45°, keseluruhan latar belakang bidang pandang yang gelap memiliki warna merah.
Kompensator λ/4 (U-TP137) juga dapat digunakan. Tata cara penggunaannya sama, hanya bidang pandang yang berwarna abu-abu, bukan merah, dan benda bersinar dengan tanda bias positif, dan digelapkan dengan tanda negatif.
Penentuan kuantitatif perbedaan jalur sinar cahaya, dinyatakan dalam nanometer, dilakukan dengan menggunakan kompensator Braque Köhler. Untuk melakukan ini, gunakan rumus:
Γ=Γλ×sinφ
dimana λ adalah konstanta yang ditandai pada kompensator oleh pabrikan, φ adalah sudut rotasi kompensator relatif terhadap bidang polarisasi alat analisa.
Indeks bias suatu benda anisotropik ditentukan dengan membandingkannya (di bawah mikroskop) dengan benda uji yang diletakkan di sebelahnya. Cairan standar dengan indeks bias yang diketahui digunakan sebagai benda uji. Benda dan sampel diletakkan berdampingan di atas panggung. Ketika indeks biasnya tidak cocok, garis cahaya yang disebut garis Beck akan terlihat antara benda dan sampel. Menaikkan tabung mikroskop relatif terhadap posisi fokus menyebabkan pergeseran garis Beck ke arah medium, sehingga memberikan efek pembiasan yang lebih nyata. Ketika indeks bias benda dan sampel bertepatan, garis Beck menghilang. Biasanya, indeks bias ditentukan dalam cahaya monokromatik untuk garis spektrum natrium (pada panjang gelombang 589 nm dan suhu 20°C). Pembiasan harus ditentukan untuk dua bidang polarisasi yang saling tegak lurus. Untuk tujuan ini, alat analisa dikeluarkan dan pembiasan benda dicatat dalam dua posisi yang saling tegak lurus. Perbedaan kedua indeks bias (ng - nk) mencirikan kekuatan bias.
FITUR PENGOLAHAN BAHAN DAN PERSIAPAN PERSIAPAN
Memperbaiki bahan untuk mikroskop polarisasi dalam formalin asam tidak diinginkan, karena pigmen formalin yang dibentuk oleh interaksi hemoglobin jaringan dengan formaldehida asam memiliki sifat anisotropik dan menyulitkan mempelajari sediaan dalam cahaya terpolarisasi. G. Scheuner dan J. Hutschenreiter (1972) merekomendasikan penggunaan formalin netral 10%, larutan kalsium-formol Baker, dan cairan Carnoy untuk tujuan ini.
Durasi fiksasi dalam formalin netral 10% adalah 24 - 72 jam pada suhu 4 °C, dalam larutan kalsium-formol Baker - 16 - 24 jam pada suhu 4 °C. Fiksasi dalam kalsium-formol terutama disukai ketika mempelajari senyawa lipid-protein. Cairan Carnoy dengan cepat memenuhi jaringan. Potongan dengan ketebalan 1 - 2 mm dapat diprofilkan hanya dalam 1 jam pada suhu 4 °C. Fiksasi dalam cairan Carnoy tidak cocok untuk studi lipid. Selain itu, cairan Zenker juga digunakan, terutama bila diresapi dengan garam emas dan perak. Setelah pengobatan dengan campuran cairan Zenker dan asam asetat, sel darah merah memperoleh kemampuan untuk menjalani birefringence.
Saat memeriksa jaringan padat (tulang, gigi) di mikroskop polarisasi, selain dekalsifikasi asam, diperlukan proses tambahan untuk menghilangkan serat kolagen. Untuk tujuan ini, bagian-bagian jaringan tersebut direbus selama beberapa menit dalam campuran gliserin dan kalium hidroksida (10 ml gliserin dan 2 butir kalium hidroksida) sampai benar-benar memutih, kemudian alkali dikeringkan dengan hati-hati, bagian tersebut dicuci dengan air. dan dipindahkan dengan pinset ke panggung mikroskop.
Untuk mikroskop polarisasi, bagian parafin, beku dan cryostat digunakan. Bagian beku yang tidak diwarnai untuk diperiksa di bawah cahaya terpolarisasi tertanam dalam gliserol. Bagian cryostat yang tidak diperbaiki cocok untuk analisis mikroskopis polarisasi segera setelah persiapan. Karena sensitivitasnya yang tinggi terhadap efek merusak dari berbagai faktor lingkungan, bagian ini tetap direkomendasikan untuk difiksasi dalam larutan formaldehida netral 10% atau larutan kalsium-formol.
Hasil pemeriksaan mikroskop polarisasi dipengaruhi oleh ketebalan potongan histologis. Saat mempelajari bagian tebal, kondisi diciptakan untuk superposisi struktur anisotropik yang berbeda satu sama lain. Selain itu, dengan ketebalan irisan yang berbeda, sifat anisotropik dari struktur yang diteliti dapat berubah, sehingga sangat penting, terutama dalam studi perbandingan, untuk memastikan ketebalan irisan yang konstan. Ketebalan bagian maksimum yang disarankan tidak boleh melebihi 10 µm.
Prasyarat lainnya adalah dewaxing bagian yang hati-hati, karena residu parafin yang tidak dihilangkan memberikan efek anisotropi yang nyata, sehingga mempersulit penelitian. Parafin bertahan lama terutama pada sel darah merah dan inti sel. Untuk menghilangkan parafin sepenuhnya dari bagian tersebut, disarankan untuk melakukan pemrosesan berikut.
- Xilena 30 menit
- Alkohol 100% 5 menit
- Campuran metanol dan kloroform (1:1) pada suhu 50 °C selama 24 jam
- Alkohol 100% 5 menit
- Alkohol 70% 10 menit Air
Perlu juga diingat bahwa bagian yang dikenai mikroskop polarisasi tidak boleh bersentuhan dengan fenol (misalnya, bagian tersebut tidak boleh dibersihkan dalam xilena karbol).
Informasi lebih rinci tentang mikroskop polarisasi dan penggunaan kompensator dapat diperoleh dari tautan (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Jika Anda memiliki pertanyaan tentang mikroskop polarisasi, silakan hubungi Sekolah Mikroskop.
Dari semua jenis perangkat mikroskop, mikroskop polarisasi adalah yang paling rumit secara teknis. Perhatian terhadap desain perangkat dalam hal kemampuan manufaktur disebabkan oleh kebutuhan untuk memperoleh gambar dengan kualitas terbaik, yang secara langsung dipengaruhi oleh desain bagian optik dan pencahayaan mikroskop. Area utama penggunaan perangkat polarisasi untuk mikroskop adalah studi tentang mineral, kristal, terak, benda anisotropik, tekstil dan produk tahan api, serta bahan lain yang dicirikan oleh birefringence. Prinsip terakhir digunakan untuk membentuk gambar pada perangkat mikroskop di mana sampel yang diteliti disinari dengan sinar polarisasi. Dalam hal ini, sifat anisotropik sampel muncul setelah perubahan arah pancaran. Untuk tujuan ini, desain mikroskop polarisasi mencakup filter bidang yang berputar pada bidang berbeda relatif satu sama lain: penganalisis berputar 180 derajat, dan polarizer berputar 360. Fitur utama perangkat mikroskop dalam cahaya terpolarisasi adalah kemampuannya untuk melakukan ortoskopik dan studi conoscopic, yang tidak tersedia pada sebagian besar jenis mikroskop lainnya.
Mempelajari sampel di bawah mikroskop polarisasi dimulai dengan memasang polarizer pada bagian penerangan mikroskop di bawah kondensor, di sebelah diafragma bukaan. Dalam hal ini, penganalisis terletak di antara lensa mata dan lensa - di belakang lensa di sepanjang jalur sinar cahaya. Dengan pengaturan yang benar dari perangkat mikroskop tersebut, setelah melintasi bidang filter, bidang yang terlihat akan menjadi gelap secara merata, membentuk apa yang disebut efek kepunahan. Setelah menyelesaikan pengaturan perangkat, sampel yang diteliti dipasang di atas panggung dan dipelajari. Tabel mikroskop polarisasi dipusatkan relatif terhadap sumbu optik dan dapat diputar 360 derajat, dan pada perangkat serupa untuk keperluan laboratorium dan penelitian juga memiliki vernier. Optik dan sistem pencahayaan mikroskop polarisasi memiliki kualitas tertinggi dan presisi manufaktur yang memungkinkan Anda memperoleh gambar sejelas mungkin tanpa distorsi. Seringkali, seperangkat perangkat untuk mempelajari sampel dalam cahaya terpolarisasi mencakup kompensator dan lensa Bertrand. Yang pertama memungkinkan untuk mempelajari struktur mineral secara efektif, dan lensa memungkinkan Anda memperbesar dan memfokuskan area pengamatan ketika terjadi perubahan gambar setelah memutar panggung. Saat ini ada tiga jenis utama perangkat mikroskop tersebut di pasaran - mikroskop penelitian dan laboratorium yang telah disebutkan, serta mikroskop polarisasi yang berfungsi.