Mechanizm działania enzymów. Budowa i mechanizm działania enzymów Mechanizm działania enzymów teoria półproduktów
Do niedawna uważano, że absolutnie wszystkie enzymy są substancjami o charakterze białkowym. Jednak w latach 80. odkryto aktywność katalityczną niektórych RNA o niskiej masie cząsteczkowej. Enzymy te to tzw rybozymy. Reszta, ponad 2000 obecnie znanych enzymów, ma charakter białkowy i charakteryzuje się wszystkimi właściwościami białek.
Ze względu na strukturę enzymy dzielą się na:
1.prosty lub jednoskładnikowy;
2. złożone lub dwuskładnikowe (holoenzymy).
Proste enzymy są prostymi białkami i po hydrolizie rozkładają się tylko na aminokwasy. Do prostych enzymów należą enzymy hydrolityczne (pepsyna, trypsyna, ureaza itp.).
Białka złożone są białkami złożonymi i oprócz łańcuchów polipeptydowych zawierają składnik niebiałkowy ( kofaktor). Większość enzymów to złożone białka. Część białkowa enzymu dwuskładnikowego nazywa się apoenzym. Kofaktory mogą mieć różną siłę wiązania z apoenzymem.Jeśli kofaktor jest mocno związany z łańcuchem polipeptydowym, nazywa się to zespół protetyczny. Istnieje wiązanie kowalencyjne między grupą prostetyczną a apoenzymem.
Jeśli kofaktor można łatwo oddzielić od apoenzymu i jest zdolny do niezależnego istnienia, wówczas taki kofaktor nazywa się koenzym.
Pomiędzy apoenzymem a koenzymem wiązania są słabe - wodorowe, elektrostatyczne itp.
Charakter chemiczny kofaktorów jest niezwykle zróżnicowany. Rolę kofaktorów w enzymach dwuskładnikowych pełnią:
1 - większość witamin (E, K, Q, C, H, B 1, B 2, B 6, B 12 itp.);
2 związki o charakterze nukleotydowym (NAD, NADP, ATP, CoA, FAD, FMN), a także szereg innych związków;
3 - kwas liponowy;
4 - wiele metali dwuwartościowych (Mg 2+, Mn 2+, Ca 2+ itp.).
Miejsce aktywne enzymów.
Enzymy to substancje wielkocząsteczkowe, których masa cząsteczkowa sięga kilku milionów.Cząsteczki substratów oddziałujących z enzymami mają zwykle znacznie mniejsze rozmiary. Dlatego naturalne jest założenie, że nie cała cząsteczka enzymu jako całość oddziałuje z substratem, ale tylko jej część, tak zwane „centrum aktywne” enzymu.
Centrum aktywne enzymu to część jego cząsteczki, która bezpośrednio oddziałuje z substratami i bierze udział w akcie katalizy.
Centrum aktywne enzymu powstaje na poziomie struktury trzeciorzędowej. Dlatego podczas denaturacji, gdy trzeciorzędowa struktura zostaje zerwana, enzym traci swoją aktywność katalityczną!
Centrum aktywne z kolei składa się z:
1. centrum katalityczne, które przeprowadza przemianę chemiczną substratu;
2. centrum substratu („kotwica” lub obszar kontaktu), który zapewnia przyłączenie substratu do enzymu, tworzenie kompleksu enzym-substrat.
Nie zawsze jest możliwe wytyczenie wyraźnej linii między centrami katalitycznymi i substratowymi; w niektórych enzymach pokrywają się one lub nakładają.
Oprócz centrum aktywnego w cząsteczce enzymu znajduje się tzw. centrum allosteryczne. Jest to odcinek cząsteczki enzymu, w wyniku dodania pewnej substancji niskocząsteczkowej (efektor), na którą zmienia się trzeciorzędowa struktura enzymu. Prowadzi to do zmiany konfiguracji miejsca aktywnego, aw konsekwencji do zmiany aktywności enzymu. Jest to zjawisko allosterycznej regulacji aktywności enzymów.
Wiele enzymów to multimery (lub oligomery), tj. składają się z dwóch lub więcej podjednostek protomeru (podobnie jak czwartorzędowa struktura białka).
Wiązania między podjednostkami są w większości niekowalencyjne. Enzym wykazuje maksymalną aktywność katalityczną właśnie w postaci multimeru. Dysocjacja na protomery gwałtownie zmniejsza aktywność enzymu.
Enzymy - multimery zwykle zawierają wyraźną liczbę podjednostek (2-4), tj. są di- i tetramerami. Chociaż heksa- i oktamery (6-8) są znane, a trimery i pentamery (3-5) są niezwykle rzadkie.
Enzymy multimeryczne mogą być zbudowane z tych samych lub różnych podjednostek.
Jeśli enzymy multimeryczne są utworzone z różnych typów podjednostek, mogą istnieć jako wiele izomerów. Wiele form enzymu nazywa się izoenzymami (izoenzymami lub izozymami).
Na przykład enzym składa się z 4 podjednostek typu A i B. Może tworzyć 5 izomerów: AAAA, AAAB, AABB, ABBB, BBBB. Te izomeryczne enzymy są izoenzymami.
Izoenzymy katalizują tę samą reakcję chemiczną, zwykle działają na ten sam substrat, ale różnią się niektórymi właściwościami fizykochemicznymi (masa cząsteczkowa, skład aminokwasowy, ruchliwość elektroforetyczna itp.), lokalizacją w narządach i tkankach.
Szczególną grupę enzymów stanowią tzw. kompleksy multimeryczne. Są to układy enzymów, które katalizują kolejne etapy przemian substratu. Takie układy charakteryzują się siłą wiązania i ścisłą organizacją przestrzenną enzymów, co zapewnia minimalną drogę przejścia substratu i maksymalną szybkość jego przemiany.
Przykładem jest kompleks wieloenzymatyczny, który przeprowadza oksydacyjną dekarboksylację kwasu pirogronowego. Kompleks składa się z 3 rodzajów enzymów (M.v. = 4 500 000).
Mechanizm działania enzymów
Mechanizm działania enzymów jest następujący. Kiedy substrat łączy się z enzymem, powstaje niestabilny kompleks enzym-substrat. Aktywuje cząsteczkę substratu dzięki:
1. polaryzacja wiązań chemicznych w cząsteczce substratu i redystrybucja gęstości elektronowej;
2. deformacja wiązań biorących udział w reakcji;
3. zbieżność i niezbędna wzajemna orientacja cząsteczek substratu (S).
Cząsteczka substratu jest unieruchomiona w centrum aktywnym enzymu w konfiguracji napiętej, w stanie zdeformowanym, co prowadzi do osłabienia siły wiązań chemicznych i obniżenia poziomu bariery energetycznej, tj. substrat jest aktywowany.
W procesie reakcji enzymatycznej wyróżnia się 4 etapy:
1 – przyłączenie cząsteczki substratu do enzymu i utworzenie kompleksu enzym-substrat;
2 - przemiana substratu pod wpływem enzymu, udostępnienie go do reakcji chemicznej, tj. aktywacja substratu;
3 - reakcja chemiczna;
4 - oddzielenie produktów reakcji od enzymu.
Można to zapisać w postaci diagramu:
E + SESES* EPE + P
gdzie: Е – enzym, S – substrat, S* – aktywowany substrat, Р – produkt reakcji.
W pierwszym etapie ta część cząsteczki substratu, która nie ulega przemianom chemicznym, jest przyłączana do centrum substratu za pomocą oddziaływań słabych. Do powstania kompleksu enzym-substrat (ES) muszą być spełnione trzy warunki, które decydują o wysokiej specyficzności działania enzymu.
Warunki tworzenia kompleksu enzym-substrat:
1.zgodność strukturalna między substratem a miejscem aktywnym enzymu. Według Fischera powinny pasować do siebie „jak klucz do zamka”. To podobieństwo jest zapewnione na poziomie trzeciorzędowej struktury enzymu, tj. przestrzenny układ grup funkcyjnych ośrodka aktywnego.
2. zgodność elektrostatyczna centrum aktywne enzymu i substrat, co wynika z interakcji grup o przeciwnych ładunkach.
3.elastyczność struktury trzeciorzędowej enzymu - "konformizm indukowany". Zgodnie z teorią dopasowania wymuszonego lub indukowanego katalitycznie aktywna konfiguracja cząsteczki enzymu może powstać dopiero w momencie przyłączenia substratu w wyniku jego działania deformującego zgodnie z zasadą „ręka-rękawica”.
Mechanizm działania enzymów jednoskładnikowych i dwuskładnikowych jest podobny.
Zarówno apoenzym, jak i koenzym biorą udział w tworzeniu kompleksu enzym-substrat w złożonych enzymach. W tym przypadku centrum substratu jest zwykle zlokalizowane na apoenzymie, a koenzym bierze bezpośredni udział w akcie chemicznej przemiany substratu. W ostatnim etapie reakcji apoenzym i koenzym są uwalniane w postaci niezmienionej.
Na etapach 2 i 3 przemiana cząsteczki substratu jest związana z rozrywaniem i zamykaniem wiązań kowalencyjnych.
Po przeprowadzeniu reakcji chemicznych enzym przechodzi do stanu pierwotnego, a produkty reakcji są rozdzielane.
Zdolność enzymu do katalizowania określonego typu reakcji nazywa się specyficzność.
Istnieją trzy rodzaje specyficzności:
1.specyficzność względna lub grupowa- enzym działa na określony rodzaj wiązania chemicznego (np. enzym pepsyna rozszczepia wiązanie peptydowe);
2.absolutna specyficzność - enzym działa tylko na jeden ściśle określony substrat (np. enzym ureaza rozszczepia wiązanie amidowe tylko w moczniku);
3.specyficzność stechiometryczna- enzym działa tylko na jeden ze stereoizomerów (np. enzym glukozydaza fermentuje tylko D-glukozę, ale nie działa na L-glukozę).
Specyfika enzymu zapewnia uporządkowanie przebiegu reakcji metabolicznych.
Wyślij swoją dobrą pracę w bazie wiedzy jest prosta. Skorzystaj z poniższego formularza
Studenci, doktoranci, młodzi naukowcy, którzy korzystają z bazy wiedzy w swoich studiach i pracy, będą Wam bardzo wdzięczni.
Wysłany dnia http:// www. wszystkiego najlepszego. en/
Budowa, właściwości i mechanizm działania enzymów
Treść
- Struktura enzymów
- Mechanizm działania enzymów
- Nazewnictwo enzymów
- Klasyfikacja enzymów
- Właściwości enzymów
- Fermentologia kliniczna
- Literatura
Krótka historia fermentologii
Eksperymentalne badanie enzymów w XIX wieku zbiegło się z badaniem procesów fermentacji drożdży, co znalazło odzwierciedlenie w terminach „enzymy” i „enzymy”. Nazwa enzymy pochodzi od łacińskiego słowa fermentatio – fermentacja. Termin enzymy wywodzi się od pojęcia enzym – z drożdży. Nazwom tym nadano początkowo różne znaczenia, obecnie są one synonimami.
Pierwszą reakcję enzymatyczną scukrzania skrobi ze słodem zbadał krajowy naukowiec K.S. Kirchhoffa w 1814 r. Następnie podjęto próby wyizolowania enzymów z komórek drożdży (E. Buechner, 1897). Na początku XX wieku L. Michaelis i M. Menten opracowali teorię katalizy enzymatycznej. W 1926 roku D. Sumner jako pierwszy wyizolował oczyszczony preparat enzymu ureazy w stanie krystalicznym. W 1966 roku B. Merrifieldowi udało się sztucznie zsyntetyzować enzym RNazę.
Struktura enzymów
Enzymy to wysoce wyspecjalizowane białka zdolne do zwiększania szybkości reakcji w organizmach żywych. Enzymy są biologicznymi katalizatorami.
Wszystkie enzymy są białkami, zazwyczaj kulistymi. Mogą odnosić się zarówno do białek prostych, jak i złożonych. Część białkowa enzymu może składać się z jednego łańcucha polipeptydowego - białek monomerycznych - enzymów (na przykład pepsyny). Szereg enzymów to białka oligomeryczne, które zawierają kilka protomerów lub podjednostek. Protomery, łącząc się w strukturę oligomeryczną, są połączone spontanicznie słabymi wiązaniami niekowalencyjnymi. W procesie asocjacji (współpracy) w poszczególnych protomerach zachodzą zmiany strukturalne, w wyniku których aktywność enzymu wyraźnie wzrasta. Separacja (dysocjacja) protomerów i ich asocjacja w białko oligomeryczne jest mechanizmem regulującym aktywność enzymów.
Podjednostki (protomery) w oligomerach mogą być takie same lub różne pod względem pierwszorzędowej - trzeciorzędowej struktury (konformacji). W przypadku połączenia różnych protomerów w oligomeryczną strukturę enzymu powstaje wiele form tego samego enzymu - izoenzymy .
Izoenzymy katalizują tę samą reakcję, ale różnią się zestawem podjednostek, właściwościami fizykochemicznymi, ruchliwością elektroforetyczną, powinowactwem do substratów, aktywatorami i inhibitorami. Na przykład, dehydrogenaza mleczanowa (LDH) - enzym utleniający kwas mlekowy do kwasu pirogronowego to tetramer. Składa się z czterech protomerów dwóch typów. Jeden typ protomeru jest oznaczony jako H (wyizolowany z mięśnia sercowego), drugi protomer jest oznaczony jako M (wyizolowany z mięśnia szkieletowego). Istnieje 5 możliwych kombinacji tych protomerów w LDH: H 4 , H 3 M, H 2 M 2 , H 1 M 3 , M 4 .
Biologiczna rola izoenzymów.
· Izoenzymy zapewniają przebieg reakcji chemicznych zgodnie z warunkami panującymi w różnych narządach. Tak więc izoenzym LDH 1 - ma wysokie powinowactwo do tlenu, dzięki czemu jest aktywny w tkankach o dużej szybkości reakcji oksydacyjnych (erytrocyty, mięsień sercowy). Izoenzym LDH 5 jest aktywny w obecności wysokiego stężenia mleczanu, najbardziej charakterystycznego dla tkanki wątroby
Wyraźna specyficzność narządowa służy do diagnozowania chorób różnych narządów.
Izoenzymy zmieniają swoją aktywność wraz z wiekiem. Tak więc u płodu z brakiem tlenu dominuje LDH 3, a wraz z wiekiem, wzrostem podaży tlenu, wzrasta udział LDH 2.
energia inhibitora aktywatora enzymu
Jeśli enzym jest złożonym białkiem, to składa się z białka i części niebiałkowej. Część białkowa jest termolabilną częścią enzymu o dużej masie cząsteczkowej i nazywa się apoenzym . Ma specyficzną budowę i decyduje o specyfice enzymów.
Niebiałkowa część enzymu nazywa się kofaktor ( koenzym ). Kofaktorem są najczęściej jony metali, które mogą silnie wiązać się z apoenzymem (np. Zn w enzymie anhydrazy węglanowej, Cu w enzymie oksydazy cytochromowej). Koenzymy to najczęściej substancje organiczne, które są słabiej związane z apoenzymem. Koenzymy to nukleotydy NAD, FAD. koenzym - niskocząsteczkowa, termostabilna część enzymu. Jego rolą jest to, że określa upakowanie przestrzenne (konformację) apoenzymu i determinuje jego aktywność. Kofaktory mogą przenosić elektrony, grupy funkcyjne, uczestniczyć w tworzeniu dodatkowych wiązań między enzymem a substratem.
Pod względem funkcjonalnym zwyczajowo wyróżnia się dwa ważne miejsca w cząsteczce enzymu: miejsce aktywne i miejsce allosteryczne.
Aktywny Centrum - jest to odcinek cząsteczki enzymu, który oddziałuje z substratem i bierze udział w procesie katalitycznym. Centrum aktywne enzymu tworzą rodniki aminokwasowe oddalone od siebie w strukturze pierwszorzędowej. Aktywne centrum ma trójwymiarowe opakowanie, które najczęściej zawiera
Seryna grup OH
SH - cysteina
lizyna NH2
g-COOH kwas glutaminowy
W centrum aktywnym wyróżnia się dwie strefy – strefę wiązania z substratem oraz strefę katalityczną.
Strefa wiążący zwykle ma sztywną strukturę, do której komplementarnie przyłączone jest podłoże reakcji. Na przykład trypsyna rozszczepia białka w miejscach bogatych w dodatnio naładowany aminokwas lizynę, ponieważ jej strefa wiązania zawiera ujemnie naładowane reszty kwasu asparaginowego.
katalityczny strefa - jest to miejsce centrum aktywnego, które bezpośrednio oddziałuje na podłoże i pełni funkcję katalityczną. Ta strefa jest bardziej mobilna, można w niej zmieniać względne położenie grup funkcyjnych.
W wielu enzymach (często oligomerycznych) oprócz centrum aktywnego występuje allosteryczny działka - region cząsteczki enzymu oddalony od centrum aktywnego i oddziałujący nie z substratem, ale z dodatkowymi substancjami (regulatorami, efektorami). W enzymach allosterycznych jedna podjednostka może mieć miejsce aktywne, podczas gdy druga ma miejsce allosteryczne. Enzymy allosteryczne zmieniają swoją aktywność w następujący sposób: efektor (aktywator, inhibitor) oddziałuje na podjednostkę allosteryczną i zmienia jej strukturę. Wówczas zmiana konformacji podjednostki allosterycznej, zgodnie z zasadą przemian kooperacyjnych, pośrednio zmienia strukturę podjednostki katalitycznej, czemu towarzyszy zmiana aktywności enzymu.
Mechanizm działania enzymów
Enzymy mają szereg ogólnych właściwości katalitycznych:
nie przesuwaj równowagi katalitycznej
nie są zużywane podczas reakcji
katalizują tylko termodynamicznie rzeczywiste reakcje. Takie reakcje to te, w których początkowa energia dostarczana cząsteczkom jest większa niż końcowa.
Podczas reakcji pokonywana jest wysoka bariera energetyczna. Różnica między energią tego progu a początkowym poziomem energii jest energią aktywacji.
Szybkość reakcji enzymatycznych zależy od energii aktywacji i szeregu innych czynników.
Stałą szybkości reakcji chemicznej określa równanie:
DO= P* Z* mi - ( Ea / RT )
K - stała szybkości reakcji
P - współczynnik przestrzenny (steryczny).
Z to liczba oddziałujących cząsteczek
E a - energia aktywacji
R - stała gazowa
T - uniwersalna temperatura bezwzględna
e jest podstawą logarytmów naturalnych
W tym równaniu Z, e, R, T są stałymi, a P i Ea są zmiennymi. Ponadto istnieje bezpośrednia zależność między szybkością reakcji a współczynnikiem sterycznym oraz odwrotna i mocowa zależność między szybkością a energią aktywacji (im mniejsze Ea, tym większa szybkość reakcji).
Mechanizm działania enzymów sprowadza się do wzrostu współczynnika sterycznego przez enzymy i spadku energii aktywacji.
Redukcja energii aktywacji przez enzymy
Na przykład energia rozszczepienia H 2 O 2 bez enzymów i katalizatorów wynosi 18 000 kcal na mol. Jeśli stosuje się platynę i wysoką temperaturę, spada ona do 12 000 kcal/mol. Z pomocą enzymu katalaza energia aktywacji wynosi tylko 2000 kcal/mol.
Spadek Ea następuje w wyniku tworzenia pośrednich kompleksów enzym-substrat według schematu: F+ S <=> FS-złożony > F + produkty reakcje. Po raz pierwszy możliwość tworzenia kompleksów enzym-substrat wykazali Michaelis i Menten. Następnie wyizolowano wiele kompleksów enzym-substrat. Zaproponowano wyjaśnienie wysokiej selektywności enzymów podczas interakcji z substratem teoria " klucz I zamek" Rybak. Zgodnie z nią enzym oddziałuje z substratem tylko wtedy, gdy bezwzględnie sobie odpowiadają (komplementarność), jak klucz i zamek. Teoria ta wyjaśniała specyfikę enzymów, ale nie ujawniała mechanizmów ich działania na substrat. Później opracowano teorię indukowanego dopasowania enzym-substrat - teoria Koshland(teoria „gumowych rękawiczek”). Jego istota jest następująca: tworzy się centrum aktywne enzymu, które zawiera wszystkie grupy funkcyjne jeszcze przed interakcją z substratem. Jednak te grupy funkcyjne są w stanie nieaktywnym. W momencie przyłączenia substratu indukuje zmiany położenia i struktury rodników w centrum aktywnym enzymu. W rezultacie centrum aktywne enzymu staje się aktywne pod działaniem substratu i z kolei zaczyna działać na substrat, tj. interakcja między miejscem aktywnym enzymu a substratem. W rezultacie podłoże przechodzi w niestabilny, niestabilny stan, co prowadzi do spadku energii aktywacji.
Oddziaływanie enzymu i substratu może polegać na reakcjach podstawienia nukleofilowego, podstawienia elektrofilowego i odwodnienia substratu. Możliwe jest również krótkotrwałe oddziaływanie kowalencyjne grup funkcyjnych enzymu z substratem. Zasadniczo następuje geometryczna reorientacja grup funkcyjnych aktywnego centrum.
Zwiększanie współczynnika sterycznego przez enzymy
Współczynnik steryczny wprowadza się dla reakcji z udziałem dużych cząsteczek o strukturze przestrzennej. Współczynnik steryczny pokazuje odsetek udanych zderzeń aktywnych cząsteczek. Na przykład jest równy 0,4, jeśli 4 na 10 zderzeń aktywnych cząsteczek doprowadziło do powstania produktu reakcji.
Enzymy zwiększają współczynnik steryczny, ponieważ zmieniają strukturę cząsteczki substratu w kompleks enzym-substrat, w wyniku czego zwiększa się komplementarność enzymu i substratu. Ponadto enzymy, dzięki swoim aktywnym centrom, porządkują rozmieszczenie cząsteczek substratu w przestrzeni (przed oddziaływaniem z enzymem cząsteczki substratu układają się przypadkowo) i ułatwiają przebieg reakcji.
Nazewnictwo enzymów
Enzymy mają kilka rodzajów nazw.
1) Nazwy zwyczajowe (trypsyna, pepsyna)
2) Nazewnictwo robocze. W tej nazwie enzymu jest końcówka - aza, do której dodaje się:
do nazwy substratu (sacharoza, amylaza),
od rodzaju wiązania, na które działa enzym (peptydaza, glikozydaza),
· do rodzaju reakcji, procesu (syntetaza, hydrolaza).
3) Każdy enzym ma nazwę klasyfikacyjną, która odzwierciedla rodzaj reakcji, rodzaj substratu i koenzymu. Na przykład: LDH - L mleczan-NAD + - oksydoreduktaza.
Klasyfikacja enzymów
Klasyfikacja enzymów została opracowana w 1961 roku. Zgodnie z klasyfikacją każdy enzym znajduje się w określonej klasie, podklasie, podklasie i ma numer seryjny. Pod tym względem każdy enzym posiada cyfrowy szyfr, w którym pierwsza cyfra oznacza klasę, druga podklasę, trzecia podklasę, czwarta numer seryjny (LDG: 1,1,1,27). Wszystkie enzymy są podzielone na 6 klas.
1. Oksydoreduktazy
2. Transferazy
3. Hydrolazy
4. Liasy
5. Izomerazy
6. Syntetazy (ligazy)
oksydoreduktaza .
Enzymy katalizujące procesy redoks. Ogólny widok reakcji: A ok + B vos \u003d A vost + B ok. Ta klasa enzymów obejmuje kilka podklas:
1 . dehydrogenazy, katalizują reakcje, usuwając wodór z utlenionej substancji. Mogą być tlenowe (przenoszą wodór na tlen) i beztlenowe (przenoszą wodór nie na tlen, ale na inną substancję).
2. Oksygenazy - enzymy, które katalizują utlenianie poprzez dodanie tlenu do utlenionej substancji. Jeśli przyłączony jest jeden atom tlenu, zaangażowane są monooksygenazy, jeśli dołączone są dwa atomy tlenu, zaangażowane są dioksygenazy.
3. peroksydazy - enzymy katalizujące utlenianie substancji z udziałem nadtlenków.
Transferazy .
Enzymy, które przeprowadzają wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe przenoszenie grup funkcyjnych z jednej substancji do drugiej zgodnie ze schematem: AB + C = A + BC. W zależności od rodzaju przenoszonych grup transferaz wyróżnia się podklasy: aminotransferazy, metylotransferazy, sulfotransferazy, acylotransferazy (przenoszące reszty kwasów tłuszczowych), fosfotransferazy (przenoszące reszty kwasu fosforowego).
Hydrolazy .
Enzymy tej klasy katalizują zerwanie wiązania chemicznego z dodatkiem wody w miejscu zerwania, czyli reakcję hydrolizy według schematu: AB + HOH = AH + BOH. W zależności od rodzaju zerwanych wiązań wyróżnia się podklasy hydrolaz: peptydazy rozszczepiają wiązania peptydowe (pepsyna), glikozydazy - wiązania glikozydowe (amylaza), esterazy - wiązania estrowe (lipaza).
Liase .
Liazy katalizują zerwanie wiązania chemicznego bez dodatku wody w miejscu zerwania. W tym przypadku wiązania podwójne powstają w podłożach zgodnie ze schematem: AB \u003d A + B. Podklasy liaz zależą od tego, między którymi atomami wiązanie jest zerwane i jakie substancje powstają. Aldolazy zrywają wiązanie między dwoma atomami węgla (na przykład aldolaza 1,6-difosforanu fruktozy „tnie” fruktozę i dwie triozy). Liazy obejmują enzymy dekarboksylazy (odszczepiają dwutlenek węgla), dehydratazy - „wycinają” cząsteczki wody.
izomerazy .
Izomerazy katalizują wzajemne konwersje różnych izomerów. Na przykład fosfoheksoizomeraza przekształca fruktozę w glukozę. Podklasy izomeraz obejmują mutazy (fosfoglukomutaza przekształca glukozo-1-fosforan w glukozo-6-fosforan), epimerazy (na przykład przekształcają rybozę w ksylulozę), tautomerazy
syntetazy ( ligazy ).
Enzymy tej klasy katalizują reakcje syntezy nowych substancji dzięki energii ATP zgodnie ze schematem: A + B + ATP \u003d AB. Na przykład syntetaza glutaminy łączy kwas glutaminowy, NH 3 + z udziałem ATP, tworząc glutaminę.
Właściwości enzymów
Enzymy, oprócz właściwości typowych dla katalizatorów nieorganicznych, mają pewne różnice w stosunku do katalizatorów nieorganicznych. Obejmują one:
wyższa aktywność
wyższa specyficzność
łagodniejsze warunki katalizy
zdolność do regulowania aktywności
wysoki katalityczny działalność enzymy .
Enzymy charakteryzują się wysoką aktywnością katalityczną. Na przykład jedna cząsteczka anhydrazy węglanowej w ciągu jednej minuty katalizuje tworzenie (lub rozszczepianie) 36 milionów cząsteczek kwasu węglowego (H 2 CO 3). Wysoką aktywność enzymów tłumaczy się mechanizmem ich działania: zmniejszają one energię aktywacji i zwiększają przestrzenność (współczynnik steryczny). Wysoka aktywność enzymów ma duże znaczenie biologiczne, polegające na tym, że zapewniają one wysoką szybkość reakcji chemicznych w organizmie.
wysoki specyficzność enzymy .
Wszystkie enzymy mają specyficzność, ale stopień specyficzności różni się w zależności od enzymu. Istnieje kilka typów specyficzności enzymów.
Bezwzględna specyficzność substratowa, w której enzym działa tylko na jedną określoną substancję. Na przykład enzym ureaza rozkłada tylko mocznik.
Bezwzględna specyficzność grupowa, w której enzym ma taki sam efekt katalityczny na grupę związków o podobnej strukturze. Na przykład enzym dehydrogenaza alkoholowa utlenia nie tylko C 2 H 5 OH, ale także jego homologi (alkohole metylowe, butylowe i inne).
Względna specyficzność grupowa, w której enzym katalizuje różne klasy substancji organicznych. Na przykład enzym trypsyna wykazuje aktywność peptydazy i esterazy.
Specyficzność stereochemiczna (specyficzność optyczna), w której rozszczepiana jest tylko pewna forma izomerów (formy D, L, b, c, cis - izomery trans). Na przykład LDH działa tylko na L-mleczan, oksydazy L-aminokwasów działają na L-izomery aminokwasów.
Wysoka specyficzność wynika z unikalnej struktury miejsca aktywnego dla każdego enzymu.
termolabilność enzymy .
Termolabilność - zależność aktywności enzymu od temperatury. Wraz ze wzrostem temperatury od 0 do 40 stopni aktywność enzymów wzrasta zgodnie z regułą van't Hoffa (przy wzroście temperatury o 10 stopni szybkość reakcji wzrasta 2-4 razy). Wraz z dalszym wzrostem temperatury aktywność enzymów zaczyna spadać, co tłumaczy się termiczną denaturacją cząsteczki białka enzymu. Graficznie termozależność enzymów ma postać:
Inaktywacja enzymów w temperaturze 0 stopni jest odwracalna, aw wysokich temperaturach inaktywacja staje się nieodwracalna. Ta właściwość enzymów decyduje o maksymalnej szybkości reakcji w warunkach temperatury ciała człowieka. W praktycznych działaniach medycznych należy uwzględnić termolabilność enzymów. Na przykład podczas przeprowadzania reakcji enzymatycznej w probówce konieczne jest stworzenie optymalnej temperatury. Ta właściwość enzymów może być wykorzystana w kriochirurgii, gdy wykonywana jest złożona długotrwała operacja z obniżeniem temperatury ciała, co spowalnia tempo reakcji zachodzących w organizmie i zmniejsza zużycie tlenu przez tkanki. Konieczne jest przechowywanie preparatów enzymatycznych w niskiej temperaturze. Do neutralizacji, dezynfekcji mikroorganizmów stosuje się wysokie temperatury (autoklawowanie, gotowanie narzędzi).
Fotolaczność .
Fotolabilność - zależność aktywności enzymów od działania promieni ultrafioletowych. Promieniowanie UV powoduje fotodenaturację cząsteczek białek i zmniejsza aktywność enzymów. Ta właściwość enzymów jest wykorzystywana w działaniu bakteriobójczym lamp ultrafioletowych.
Uzależnienie działalność z pH.
Wszystkie enzymy mają pewien zakres pH, w którym aktywność enzymu jest maksymalna - pH optymalne. Dla wielu enzymów optimum wynosi około 7. Jednocześnie dla pepsyny optymalne środowisko to 1-2, dla fosfatazy alkalicznej około 9. Jeśli pH odbiega od optimum, aktywność enzymu spada, co może widać z wykresu. Ta właściwość enzymów jest wyjaśniona zmianą jonizacji grup jonogennych w cząsteczkach enzymu, co prowadzi do zmiany wiązań jonowych w cząsteczce białka enzymu. Towarzyszy temu zmiana konformacji cząsteczki enzymu, a to z kolei prowadzi do zmiany jej aktywności. W warunkach organizmu zależność od pH określa maksymalną aktywność enzymów. Właściwość ta znajduje również zastosowanie praktyczne. Reakcje enzymatyczne poza organizmem zachodzą przy optymalnym pH. Przy zmniejszonej kwasowości soku żołądkowego do celów terapeutycznych przepisywany jest roztwór HCl.
Uzależnienie prędkość enzymatyczny reakcje z stężenie enzym I stężenie podłoże
Zależność szybkości reakcji od stężenia enzymu i od stężenia substratu (kinetyka reakcji enzymatycznych) przedstawiono na wykresach.
harmonogram 1 harmonogram 2
W reakcji enzymatycznej ( F+ S 2 1 FS> 3 F + P) rozróżnij prędkość trzech składowych etapów:
1 - tworzenie kompleksu enzym-substrat FS,
2 - odwrotny rozpad kompleksu enzym - substrat,
3 - rozkład kompleksu enzym-substrat z utworzeniem produktów reakcji. Szybkość każdej z tych reakcji jest zgodna z prawem akcji masowej:
V 1 \u003d K. 1 [F] * [S]
V 2 \u003d K. 2 *
V 3 \u003d K. 3 *
W momencie równowagi szybkość reakcji tworzenia FS jest równa sumie szybkości jej rozpadu: V 1 = V 2 + V 3 . Z trzech etapów reakcji enzymatycznej trzeci jest najważniejszy i najwolniejszy, ponieważ wiąże się z tworzeniem produktów reakcji. Zgodnie z powyższym wzorem nie można znaleźć prędkości V 3, ponieważ kompleks enzym-substrat jest bardzo niestabilny, pomiar jego stężenia jest trudny. W związku z tym Michaelis-Menten wprowadził Km - stałą Michaelisa i przekształcił równanie pomiaru V 3 w nowe równanie, w którym faktycznie występują mierzalne wielkości:
V 3 \u003d K 3 * * [S] / Km + [S] lub V 3 \u003d V max * [S] / Km + [S]
- początkowe stężenie enzymu
Km jest stałą Michaelisa.
Fizyczne znaczenie km: DOM = (DO 2 + K 3 ) /DO 1 . Pokazuje stosunek stałych szybkości rozkładu kompleksu enzym-substrat do stałej szybkości jego tworzenia.
Równanie Michaelisa-Mentena jest uniwersalne. Ilustruje to zależność szybkości reakcji od [S]
1. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu. Zależność ta ujawnia się przy niskich stężeniach substratu [S]
V 3
=
k 3*
[
F 0
]
*
[
S]
/
km.
W tym równaniu k 3
,
F 0
],
km -
stałych i można je zastąpić nową stałą K*. Zatem przy niskim stężeniu substratu szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do tego stężenia.
V 3
=
k*
*
[
S].
Zależność ta odpowiada pierwszej części wykresu 2.
2. Zależność szybkości od stężenia enzymu przejawia się przy wysokim stężeniu substratu.
S?Km.
W takim przypadku Km można pominąć i równanie przyjmuje postać:
V 3
=
k 3*
(([
F 0
]
*
[
S])
/
[
S])
=
k 3*
[
F 0
]
=
V maks.
Zatem przy wysokim stężeniu substratu szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu i osiąga swoją maksymalną wartość
V 3
=
k 3
[
F 0
]
=
V maks.
( trzecia część wykresu 2).
3. Pozwala na wyznaczenie wartości liczbowej Km pod warunkiem V 3 = V max /2. W tym przypadku równanie przyjmuje postać:
Vmax /2 = ((Vmax * [S]) / Km+ [S]), stąd wynika, że Km= [S]
Zatem Km jest liczbowo równe stężeniu substratu przy szybkości reakcji równej połowie maksimum. Km jest bardzo ważną cechą enzymu, mierzoną w molach (10 -2 - 10 -6 mol) i charakteryzuje specyficzność enzymu: im niższy Km, tym wyższa specyficzność enzymu.
Graficzny
definicja
stałe
Michaelisa.
Wygodniej jest użyć wykresu przedstawiającego linię prostą.
Taki wykres proponuje Lineweaver - Burke (wykres podwójnych odwrotności), co odpowiada odwrotnemu równaniu Michaelisa - Mentena
Zależność szybkości reakcji enzymatycznych od obecności aktywatorów i inhibitorów
Aktywatory
- substancje zwiększające szybkość reakcji enzymatycznych. Istnieją aktywatory specyficzne, które zwiększają aktywność jednego enzymu (HCl - aktywator pepsynogenu) oraz aktywatory niespecyficzne, które zwiększają aktywność wielu enzymów (jony Mg - aktywatory heksokinazy, K, Na - ATPazy i innych enzymów). Jony metali, metabolity, nukleotydy mogą służyć jako aktywatory.
Mechanizm działania aktywatorów
1. Uzupełnienie centrum aktywnego enzymu, w wyniku czego ułatwiona jest interakcja enzymu z substratem. Mechanizm ten posiadają głównie jony metali.
2. Aktywator allosteryczny oddziałuje z miejscem allosterycznym (podjednostką) enzymu, poprzez jego zmiany pośrednio zmienia strukturę centrum aktywnego i zwiększa aktywność enzymu. Metabolity reakcji enzymatycznych, ATP, mają działanie allosteryczne.
3. Mechanizm allosteryczny można połączyć ze zmianą oligomeryzmu enzymu. Pod działaniem aktywatora kilka podjednostek łączy się w formę oligomeryczną, co dramatycznie zwiększa aktywność enzymu. Na przykład izocytrynian jest aktywatorem enzymu karboksylazy acetylo-CoA.
4. Fosfolilacja - defosforylacja enzymów odnosi się do odwracalnej modyfikacji enzymów. Dodatek H 3 RO 4 najczęściej gwałtownie zwiększa aktywność enzymu. Na przykład dwa nieaktywne dimery enzymu fosforylazy łączą się z czterema cząsteczkami ATP, tworząc aktywną tetrameryczną fosforylowaną postać enzymu. Fosforylację enzymów można łączyć ze zmianą ich oligomeryczności. Przeciwnie, fosforylacja enzymu zmniejsza jego aktywność (na przykład fosforylacja enzymu syntetazy glikogenu)
5. Częściowa proteoliza (modyfikacja nieodwracalna). Dzięki temu mechanizmowi fragment cząsteczki zostaje odcięty od nieaktywnej formy enzymu (proenzymu), blokując centrum aktywne enzymu. Na przykład nieaktywny pepsynogen jest przekształcany w aktywną pepsynę przez HCL.
Inhibitory
-
substancje zmniejszające aktywność enzymów.
Przez
specyficzność rozróżnić inhibitory swoiste i niespecyficzne
Przez
odwracalność rozróżnić odwracalne i nieodwracalne inhibitory.
Przez
miejsce
działania istnieją inhibitory, które działają na centrum aktywne i poza centrum aktywnym.
Przez
mechanizm
działania rozróżnić inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.
Konkurencyjny
zahamowanie
.
Inhibitory tego typu mają budowę zbliżoną do substratu. Z tego powodu inhibitory i substrat konkurują o wiązanie miejsca aktywnego enzymu. Hamowanie konkurencyjne jest hamowaniem odwracalnym Działanie inhibitora kompetycyjnego można zmniejszyć, zwiększając stężenie substratu reakcji
Przykładem hamowania kompetycyjnego jest hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, która katalizuje utlenianie kwasu dikarboksylobursztynowego, przez kwas dikarboksylomalonowy, podobny strukturą do kwasu bursztynowego.
Zasada konkurencyjnego hamowania jest szeroko stosowana w opracowywaniu leków. Na przykład preparaty sulfanilamidu mają budowę zbliżoną do struktury kwasu para-aminobenzoesowego, który jest niezbędny do wzrostu mikroorganizmów. Sulfonamidy blokują enzymy drobnoustrojów niezbędne do wchłaniania kwasu para-aminobenzoesowego. Niektóre leki przeciwnowotworowe są analogami zasad azotowych i przez to hamują syntezę kwasów nukleinowych (fluorouracyl).
Graficznie hamowanie konkurencyjne ma postać:
Niekonkurencyjny
zahamowanie
.
Inhibitory niekonkurencyjne nie są strukturalnie podobne do substratów reakcji i dlatego nie mogą być wyparte przy wysokich stężeniach substratu. Istnieje kilka opcji działania niekonkurencyjnych inhibitorów:
1. Zablokowanie grupy funkcyjnej centrum aktywnego enzymu iw rezultacie spadek aktywności. Na przykład aktywność grup SH - może wiązać trucizny tiolowe odwracalnie (sole metali, rtęć, ołów) i nieodwracalnie (monojodooctan). Hamujące działanie inhibitorów tiolowych można zmniejszyć przez wprowadzenie dodatkowych substancji bogatych w grupy SH (np. unitiolu). Istnieją i są stosowane inhibitory serynowe, które blokują grupy OH - centrum aktywnego enzymów. Takie działanie mają organiczne substancje zawierające fosfofluor. Substancje te mogą w szczególności hamować grupy OH w enzymie acetylocholinoesterazy, który niszczy neuroprzekaźnik acetylocholinę.
2. Blokowanie jonów metali wchodzących w skład centrum aktywnego enzymów. Na przykład cyjanki blokują atomy żelaza, EDTA (etylenodiaminotetraoctan) blokuje jony Ca, Mg.
3. Inhibitor allosteryczny oddziałuje z miejscem allosterycznym pośrednio przez nie na zasadzie kooperatywności, zmieniając strukturę i aktywność miejsca katalitycznego. Graficznie hamowanie niekonkurencyjne ma postać:
Maksymalnej szybkości reakcji w hamowaniu niekonkurencyjnym nie można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia substratu.
Regulacja aktywności enzymów podczas metabolizmu
Adaptacja organizmu do zmieniających się warunków (dieta, wpływ środowiska itp.) jest możliwa dzięki zmianie aktywności enzymów. Istnieje kilka możliwości regulacji szybkości reakcji enzymatycznych w organizmie:
1. Zmiana tempa syntezy enzymów (mechanizm ten wymaga długiego okresu czasu).
2. Zwiększenie dostępności substratu i enzymu poprzez zmianę przepuszczalności błon komórkowych.
3. Zmiana aktywności enzymów już obecnych w komórkach i tkankach. Mechanizm ten odbywa się z dużą prędkością i jest odwracalny.
W wieloetapowych procesach enzymatycznych izolowane są kluczowe enzymy regulacyjne, które ograniczają ogólną szybkość procesu. Najczęściej są to enzymy początkowego i końcowego etapu procesu. Zmiany aktywności kluczowych enzymów zachodzą poprzez różne mechanizmy.
1. Mechanizm allosteryczny:
2. Zmiana oligomeryzmu enzymu:
Monomery są nieaktywne - oligomery są aktywne
3. Fosfolilacja - defosforylacja:
Enzym (nieaktywny) + H 3 RO 4 - fosforylowany aktywny enzym.
Mechanizm autoregulacji jest szeroko rozpowszechniony w komórkach. Mechanizmem autoregulacyjnym jest w szczególności retroinhibicja, w której produkty procesu enzymatycznego hamują enzymy w początkowych stadiach. Na przykład wysokie stężenia nukleotydów purynowych i pirymidynowych hamują nukleotydy początkowe na etapie ich syntezy.
Czasami substraty początkowe aktywują enzymy końcowe, na schemacie: substrat A aktywuje F 3 . Na przykład aktywna forma glukozy (glukozo-6-fosforan) aktywuje końcowy enzym w syntezie glikogenu z glukozy (syntetaza glikogenu).
Strukturalna organizacja enzymów w komórce
Spójność procesów metabolicznych w organizmie jest możliwa dzięki strukturalnej dysocjacji enzymów w komórkach. Poszczególne enzymy znajdują się w określonych strukturach wewnątrzkomórkowych - podział
.
Na przykład enzym potasowy, ATPaza sodowa, jest aktywny w błonie plazmatycznej. W mitochondriach aktywne są enzymy reakcji oksydacyjnych (dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza cytochromowa). W jądrze aktywne są enzymy syntezy kwasów nukleinowych (polimeraza DNA). W lizosomach aktywne są enzymy rozkładające różne substancje (RNazy, fosfatazy i inne).
Enzymy najbardziej aktywne w danej strukturze komórkowej to tzw wskaźnik
lub enzymy markerowe. Ich definicja w praktyce klinicznej odzwierciedla głębokość uszkodzenia tkanki strukturalnej. Niektóre enzymy łączą się w kompleksy polienzymatyczne, na przykład kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDC), który utlenia kwas pirogronowy.
ZasadywykrycieIilościowydefinicjeenzymy:
Wykrywanie enzymów opiera się na ich wysokiej specyficzności. Enzymy są wykrywane na podstawie ich działania, tj. po zajściu reakcji katalizowanej przez enzym. Na przykład amylaza jest wykrywana przez rozkład skrobi do glukozy.
Kryteriami wystąpienia reakcji enzymatycznej mogą być:
zanik substratu reakcji
pojawienie się produktów reakcji
zmiana właściwości optycznych koenzymu.
Oznaczanie ilościowe enzymów
Ponieważ stężenie enzymów w komórkach jest bardzo niskie, nie określa się ich rzeczywistego stężenia, ale ilość enzymu ocenia się pośrednio, na podstawie aktywności enzymu.
Aktywność enzymatyczną ocenia się na podstawie szybkości reakcji enzymatycznej zachodzącej w optymalnych warunkach (optymalna temperatura, pH, zbyt wysokie stężenie substratu). W tych warunkach szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu (V=K3).
Jednostki
działalność
(
wielkie ilości
)
enzym
W praktyce klinicznej stosuje się kilka jednostek aktywności enzymu.
1. Jednostka międzynarodowa - ilość enzymu, która katalizuje konwersję 1 mikromola substratu na minutę w temperaturze 25 0 C.
2. Katal (w układzie SI) - ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu na sekundę.
3. Aktywność właściwa - stosunek aktywności enzymu do masy białka enzymu.
4. Aktywność molekularna enzymu pokazuje, ile cząsteczek substratu ulega przemianie pod wpływem działania 1 cząsteczki enzymu.
Fermentologia kliniczna
Wykorzystanie informacji o enzymach w praktyce lekarskiej jest działem enzymologii medycznej. Obejmuje 3 sekcje:
1. Enzymodiagnostyka
2. Enzymopotologia
3. Terapia enzymatyczna
Enzymodiagnostyka
-
sekcja badająca możliwości badania aktywności enzymów do diagnozowania chorób. Aby ocenić uszkodzenie poszczególnych tkanek, stosuje się specyficzne dla narządu enzymy, izoenzymy.
W praktyce pediatrycznej, przeprowadzając diagnostykę enzymatyczną, należy wziąć pod uwagę cechy dzieci. U dzieci aktywność niektórych enzymów jest wyższa niż u dorosłych, np. wysoka aktywność LDH odzwierciedla dominację procesów beztlenowych we wczesnym okresie poporodowym. Zawartość transaminaz w osoczu krwi dzieci wzrasta w wyniku zwiększonej przepuszczalności tkanki naczyniowej. Aktywność dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest zwiększona w wyniku wzmożonego rozpadu erytrocytów. Przeciwnie, aktywność innych enzymów jest niższa niż u dorosłych. Na przykład aktywność pepsyny, enzymów trzustkowych (lipazy, amylazy) jest zmniejszona z powodu niedojrzałości komórek wydzielniczych.
Wraz z wiekiem możliwa jest redystrybucja poszczególnych izoenzymów. Tak więc u dzieci przeważa LDH 3 (postać bardziej beztlenowa), au dorosłych LDH 2 (postać bardziej tlenowa).
Enzymopatologia
- dział fermentologii zajmujący się badaniem chorób, których wiodącym mechanizmem rozwoju jest naruszenie aktywności enzymów. Należą do nich zaburzenia metaboliczne węglowodanów (galaktozemia, glikogenoza, mukopolisacharydozy), aminokwasów (fenyloketonuria, cystynuria), nukleotydów (orotaciduria), porfiryn (porfirii).
terapia enzymatyczna
-
dział fermentologii zajmujący się badaniem wykorzystania enzymów, koenzymów, aktywatorów, inhibitorów do celów terapeutycznych. Enzymy mogą być stosowane w celach substytucyjnych (pepsyna, enzymy trzustkowe), litycznych do usuwania mas martwiczych, skrzepów krwi, do rzadkich lepkich wysięków.
Literatura
1. Awdejewa, L.V. Biochemia: Podręcznik / LV Awdejewa, T.L. Aleinikova, LE Andrianowa; Pod redakcją E.S. Seweryn. - M.: GEOTAR-MED, 2013. - 768 s.
2. Auerman, T.L. Podstawy biochemii: Podręcznik / T.L. Auerman, TG Generalova, GM Suslanok. - M.: NITS INFRA-M, 2013. - 400 s.
3. Bazarnova Yu.G. Biochemiczne podstawy przetwarzania i przechowywania surowców pochodzenia zwierzęcego: Podręcznik / Yu.G. Bazarnova, T.E. Burowa, VI. Marczenko. - Sankt Petersburg: Ave. Nauka, 2011. - 192 s.
4. Baishev, I.M. Biochemia. Pytania testowe: Podręcznik / D.M. Zubairov, I.M. Baishev, R.F. Bajkejew; Pod redakcją D.M. Zubairowa. - M.: GEOTAR-Media, 2008. - 960 s.
5. Bokut, S.B. Biochemia filogenezy i ontogenezy: Podręcznik / A.A. Chirkin, EO Danchenko, S.B. Bukut; Pod sumą wyd.A. A. Czirkin. - M.: NITs INFRA-M, lis. wiedza, 2012. - 288 s.
6. Gidranowicz, VI. Biochemia: Podręcznik / VI. Gidranowicz, AV Gidranowicz. - Mińsk: TetraSystems, 2012. - 528 s.
7. Goloshchapov, A.P. Genetyczne i biochemiczne aspekty przystosowania człowieka do warunków miasta z rozwiniętym przemysłem chemicznym / A.P. Gołoszczapow. - M.: KMK, 2012. - 103 s.
8. Gunkova, PI Biochemia mleka i produktów mlecznych / K.K. Gorbatowa, PI Gunkow; Pod sumą wyd. K. K. Gorbatow. - Petersburg: GIORD, 2010. - 336 s.
9. Dimitriev, A.D. Biochemia: Podręcznik / A.D. Dimitriev, ED Ambrosiew. - M.: Daszkow i K, 2013. - 168 s.
10. Erszow, Yu.A. Biochemia ogólna i sport: Podręcznik / Yu.A. Erszow. - M.: MGU, 2010. - 368 s.
11. Erszow, Yu.A. Podstawy biochemii dla inżynierów: Podręcznik / Yu.A. Ershov, N.I. Zajcew; Pod redakcją S.I. Schukin. - M.: MSTU im. Bauman, 2010. - 359 s.
12. Kamysznikow, V.S. Podręcznik klinicznej i biochemicznej diagnostyki laboratoryjnej: W 2 tomach. W 2 tomach Podręcznik klinicznej i biochemicznej diagnostyki laboratoryjnej: W 2 tomach / V.S. Kamysznikow. - Mińsk: Białoruś, 2012. - 958 s.
13. Klopov, MI Substancje biologicznie czynne w procesach fizjologicznych i biochemicznych w organizmie zwierząt: Podręcznik / M.I. Klopov, V.I. Maksimow. - Petersburg: Lan, 2012. - 448 s.
14. Michajłow, S.S. Biochemia sportowa: Podręcznik dla uniwersytetów i szkół kultury fizycznej / S.S. Michajłow. - M.: Sow. sport, 2012. - 348 s.
15. Repnikow, B.T. Towaroznawstwo i biochemia produktów rybnych: Podręcznik / B.T. Repnikow. - M.: Daszkow i K, 2013. - 220 s.
16. Rogożyn, W.W. Biochemia mleka i mięsa: Podręcznik / V.V. Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2012. - 456 s.
17. Rogożyn, W.W. Biochemia roślin: podręcznik / V.V. Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2012. - 432 s.
18. Rogożyn, W.W. Warsztaty z fizjologii i biochemii roślin: Podręcznik / V.V. Rogożyn, TV Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2013. - 352 s.
19. Taganowicz, A.D. Biochemia patologiczna: Monografia / A.D. Taganowicz. - M.: BINOM, 2013. - 448 s.
20. Filippowicz, Yu.B. Biochemiczne podstawy życia człowieka: Podręcznik dla studentów / Yu.B. Filippowicz, A.S. Konichev, GA Sewastyanowa, N.M. Kutuzow. - M.: VLADOS, 2005. - 407 s.
21. Szczerbakow, W.G. Biochemia i towaroznawstwo surowców naftowych / V.G. Szczerbakow, V.G. Łobanow. - M.: KolosS, 2012. - 392 s.
Hostowane na Allbest.ru
...
Podobne dokumenty
Klasyfikacja, mechanizm działania enzymów, ich zastosowanie w praktycznej działalności człowieka. Funkcjonowanie enzymów jamy ustnej, żołądka, jelita cienkiego. Określenie głównych przyczyn zaburzeń pracy narządów trawiennych u młodzieży.
praca semestralna, dodano 10.05.2014
Metody oznaczania aktywności, badanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznych. Metody izolacji i oczyszczania enzymów. Badanie lokalizacji subkomórkowej. Zastosowanie enzymów jako odczynników analitycznych. Oznaczanie aktywności trypsyny.
samouczek, dodano 19.07.2009
Historia badań, funkcje i klasyfikacja enzymów: ich znaczenie medyczne i zastosowanie w reakcjach katalizowanych. Związek między enzymami a dziedzicznymi chorobami metabolicznymi. Rozwój metod leczenia, ich znaczenie w profilaktyce chorób.
prezentacja, dodano 16.04.2012
Historia odkrycia witamin; ich właściwości. Budowa chemiczna, mechanizm działania biologicznego i teoretyczna dzienna dawka witamin rozpuszczalnych w wodzie. Główne cechy grupy witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Chromatograficzne metody badań.
streszczenie, dodano 07.05.2014
Klasyfikacja i rodzaje retrowirusów jako nośników i aktywatorów onkogenów: silnie onkogenny, słabo onkogenny, mechanizm działania. Budowa, elementy i cykl rozwojowy tych wirusów. Ludzkie wirusy T-limfotropowe: epidemiologia, opis, profilaktyka.
praca semestralna, dodano 27.06.2011
Pojęcie i klasyfikacja enzymów (enzymów). Ich właściwości ogólne i odmienne od katalizatorów nieorganicznych, charakter białek. reakcje, które katalizują. Rodzaje izoenzymów i ich rola w metabolizmie. Względna aktywność enzymów w tkankach ludzkich.
prezentacja, dodano 11.11.2016
Koncepcje indukcji enzymów podrodziny CYP 3A przez ksenobiotyki i inne związki chemiczne. Cechy ontogenezy w tym procesie. Aspekty genetyczne wpływające na aktywność enzymów z podrodziny CYP 3A. Rodziny receptorów jądrowych.
praca naukowa, dodano 05.12.2009
Badanie leków pod ogólną nazwą „antybiotyki”. Antybakteryjne środki chemioterapeutyczne. Historia odkrycia antybiotyków, ich mechanizm działania i klasyfikacja. Cechy stosowania antybiotyków i ich skutki uboczne.
praca semestralna, dodano 16.10.2014
Grupa penicylin to rozwój oparty na produktach odpadowych mikroorganizmów. Podział penicylin na naturalne i syntetyczne. Mechanizm działania: działanie bakteriobójcze i rola enzymów. Charakterystyka spektrum działania, farmakokinetyka.
streszczenie, dodano 24.01.2012
Molekularne i biochemiczne podstawy terapeutycznego działania preparatów peptydowych. Mechanizm działania neuroprotektorów. Molekularny mechanizm działania actovegin, nimodypiny. Enzymatyczne i nieenzymatyczne przeciwutleniacze. Ogólne zasady działania nootropów.
RozdziałIV.3.
Enzymy
Metabolizm w organizmie można określić jako całość wszystkich przemian chemicznych, którym ulegają związki pochodzące z zewnątrz. Przemiany te obejmują wszystkie znane typy reakcji chemicznych: międzycząsteczkowe przenoszenie grup funkcyjnych, hydrolityczne i niehydrolityczne rozszczepianie wiązań chemicznych, przegrupowania wewnątrzcząsteczkowe, tworzenie nowych wiązań chemicznych i reakcje redoks. Takie reakcje zachodzą w organizmie z niezwykle dużą szybkością tylko w obecności katalizatorów. Wszystkie katalizatory biologiczne są substancjami o charakterze białkowym i nazywane są enzymami (dalej F) lub enzymami (E).
Enzymy nie są składnikami reakcji, a jedynie przyspieszają osiągnięcie równowagi poprzez zwiększenie szybkości przemian zarówno bezpośrednich, jak i odwrotnych. Przyspieszenie reakcji następuje na skutek spadku energii aktywacji - bariery energetycznej oddzielającej jeden stan układu (początkowy związek chemiczny) od drugiego (produkt reakcji).
Enzymy przyspieszają wiele różnych reakcji w organizmie. A więc dość prosta z punktu widzenia chemii tradycyjnej reakcja odszczepienia wody z kwasu węglowego z wytworzeniem CO 2 wymaga udziału enzymu, ponieważ bez niego postępuje zbyt wolno, aby regulować pH krwi. Dzięki katalitycznemu działaniu enzymów w organizmie możliwe staje się przeprowadzenie takich reakcji, które bez katalizatora przebiegałyby setki i tysiące razy wolniej.
Właściwości enzymów
1. Wpływ na szybkość reakcji chemicznej: enzymy zwiększają szybkość reakcji chemicznej, ale same nie są zużywane.
Szybkość reakcji to zmiana stężenia składników reakcji w jednostce czasu.
Jeśli idzie w kierunku do przodu, to jest proporcjonalny do stężenia reagentów; jeśli idzie w kierunku przeciwnym, to jest proporcjonalny do stężenia produktów reakcji. Stosunek szybkości reakcji do przodu i do tyłu nazywa się stałą równowagi. Enzymy nie mogą zmieniać wartości stałej równowagi, ale stan równowagi w obecności enzymów następuje szybciej.
2. Specyfika działania enzymów. W komórkach organizmu zachodzi 2-3 tysiące reakcji, z których każda jest katalizowana przez określony enzym. Specyfika działania enzymu polega na zdolności do przyspieszenia przebiegu jednej określonej reakcji bez wpływu na szybkość innych, nawet bardzo podobnych.
Wyróżnić:
Absolutny– gdy F katalizuje tylko jedną określoną reakcję ( arginaza- rozpad argininy
Względny(grupa specjalna) - F katalizuje określoną klasę reakcji (np. rozszczepienie hydrolityczne) lub reakcje z udziałem określonej klasy substancji.
Specyficzność enzymów wynika z ich unikalnej sekwencji aminokwasowej, która determinuje konformację centrum aktywnego, które oddziałuje ze składnikami reakcji.
Nazywa się substancję, której przemiana chemiczna jest katalizowana przez enzym podłoże (
S
)
.
3. Aktywność enzymów to zdolność do przyspieszania szybkości reakcji w różnym stopniu. Aktywność wyraża się w:
1) Międzynarodowe jednostki aktywności - (IU) ilość enzymu katalizującego przemianę 1 μM substratu w ciągu 1 min.
2) Katalakh (cat) - ilość katalizatora (enzymu) zdolna do przekształcenia 1 mola substratu w ciągu 1 s.
3) Aktywność właściwa - liczba jednostek aktywności (dowolnej z powyższych) w badanej próbce do całkowitej masy białka w tej próbce.
4) Rzadziej stosuje się aktywność molową - liczbę cząsteczek substratu przekształconych przez jedną cząsteczkę enzymu na minutę.
aktywność zależy od temperatura
. Ten lub inny enzym wykazuje największą aktywność w optymalnej temperaturze. Dla F żywego organizmu wartość ta mieści się w przedziale +37,0 - +39,0°
C, w zależności od rodzaju zwierzęcia. Wraz ze spadkiem temperatury ruchy Browna spowalniają, szybkość dyfuzji maleje, aw konsekwencji spowalnia proces tworzenia kompleksu między enzymem a składnikami reakcji (substratami). W przypadku wzrostu temperatury powyżej +40 - +50°
Wraz z cząsteczką enzymu, jaką jest białko, ulega procesowi denaturacji. Jednocześnie zauważalnie spada szybkość reakcji chemicznej (rys. 4.3.1.).
Aktywność enzymów zależy również od średnie pH
. Dla większości z nich istnieje pewna optymalna wartość pH, przy której ich aktywność jest maksymalna. Ponieważ komórka zawiera setki enzymów, a każdy z nich ma swoje własne optymalne granice pH, zmiana pH jest jednym z ważnych czynników w regulacji aktywności enzymatycznej. Tak więc w wyniku jednej reakcji chemicznej z udziałem pewnego enzymu, którego pH opt mieści się w przedziale 7,0 - 7,2, powstaje produkt, którym jest kwas. W tym przypadku wartość pH przesuwa się do zakresu 5,5 - 6,0. Aktywność enzymu gwałtownie spada, szybkość tworzenia produktu zwalnia, ale aktywowany jest inny enzym, dla którego te wartości pH są optymalne, a produkt pierwszej reakcji ulega dalszej przemianie chemicznej. (Kolejny przykład dotyczący pepsyny i trypsyny).
Chemiczna natura enzymów. Struktura enzymu. Centra aktywne i allosteryczne
Wszystkie enzymy są białkami o masie cząsteczkowej od 15 000 do kilku milionów Da. Zgodnie ze strukturą chemiczną są prosty enzymy (składają się tylko z AA) i złożony enzymy (mają część niebiałkową lub grupę prostetyczną). Część białkowa nazywa się apoenzym,
i niebiałkowe, jeśli jest kowalencyjnie połączone z apoenzymem, to się nazywa koenzym,
a jeśli wiązanie jest niekowalencyjne (jonowe, wodorowe) - kofaktor
. Funkcje grupy prostetycznej to: udział w akcie katalizy, kontakt enzymu z substratem, stabilizacja cząsteczki enzymu w przestrzeni.
Substancje nieorganiczne zwykle działają jako kofaktor - jony cynku, miedzi, potasu, magnezu, wapnia, żelaza, molibdenu.
Koenzymy można uznać za integralną część cząsteczki enzymu. Są to substancje organiczne, wśród których są: nukleotydy ( ATP, UMF itp.), witamin lub ich pochodnych ( TDF- z tiaminy ( W 1),
FMN- z ryboflawiny ( O 2),
koenzym A- z kwasu pantotenowego ( O 3), NAD itp.) oraz koenzymy tetrapirolowe - hemy.
W procesie katalizy reakcji z substratem styka się nie cała cząsteczka enzymu, ale pewna jej część, tzw. aktywne centrum. Ta strefa cząsteczki nie składa się z sekwencji aminokwasów, ale powstaje, gdy cząsteczka białka jest skręcona w strukturę trzeciorzędową. Oddzielne sekcje aminokwasów zbliżają się do siebie, tworząc pewną konfigurację centrum aktywnego. Ważną cechą strukturalną centrum aktywnego jest to, że jego powierzchnia jest komplementarna z powierzchnią podłoża; Reszty AA tej strefy enzymu mogą wchodzić w reakcje chemiczne z określonymi grupami substratu. Można to sobie wyobrazić miejsce aktywne enzymu pasuje do struktury substratu jak klucz i zamek.
W aktywne centrum wyróżnia się dwie strefy: ośrodek wiążący, odpowiedzialny za mocowanie podłoża, oraz ośrodek katalityczny odpowiedzialny za przemianę chemiczną podłoża. W skład centrum katalitycznego większości enzymów wchodzą takie AA jak Ser, Cys, His, Tyr, Lys. Złożone enzymy w centrum katalitycznym mają kofaktor lub koenzym.
Oprócz centrum aktywnego wiele enzymów jest wyposażonych w centrum regulacyjne (allosteryczne). Substancje wpływające na jego aktywność katalityczną oddziałują z tą strefą enzymu.
Mechanizm działania enzymów
Akt katalizy składa się z trzech następujących po sobie etapów.
1.
Tworzenie kompleksu enzym-substrat podczas interakcji przez centrum aktywne.
2.
Wiązanie substratu zachodzi w kilku punktach centrum aktywnego, co prowadzi do zmiany struktury substratu, jego deformacji w wyniku zmiany energii wiązania w cząsteczce. Jest to drugi etap i nazywa się aktywacją substratu. Kiedy to następuje, następuje pewna modyfikacja chemiczna podłoża i jego przekształcenie w nowy produkt lub produkty.
3.
W wyniku takiego przekształcenia nowa substancja (produkt) traci zdolność zatrzymywania się w centrum aktywnym enzymu, a enzym-substrat, a właściwie kompleks enzym-produkt, dysocjuje (rozpada się).
Rodzaje reakcji katalitycznych:
A + E \u003d AE \u003d BE \u003d E + B
A + B + E \u003d AE + B \u003d ABE \u003d AB + E
AB + E \u003d ABE \u003d A + B + E, gdzie E to enzym, A i B to substraty lub produkty reakcji.
Efektory enzymatyczne
- substancje, które zmieniają szybkość katalizy enzymatycznej, a tym samym regulują metabolizm. Wśród nich wyróżnia się inhibitory
- spowolnienie tempa reakcji i aktywatory
- przyspieszenie reakcji enzymatycznej.
W zależności od mechanizmu hamowania reakcji wyróżnia się inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne. Struktura cząsteczki inhibitora kompetycyjnego jest podobna do struktury substratu i pokrywa się z powierzchnią centrum aktywnego jak klucz z zamkiem (lub prawie pokrywa się). Stopień tego podobieństwa może być nawet wyższy niż z podłożem.
Jeśli A + E \u003d AE \u003d BE \u003d E + B, to I + E \u003d IE¹
Stężenie enzymu zdolnego do katalizy spada, a szybkość powstawania produktów reakcji gwałtownie spada (ryc. 4.3.2.).
Duża liczba substancji chemicznych pochodzenia endogennego i egzogennego (tj. powstających w organizmie i pochodzących z zewnątrz - odpowiednio ksenobiotyki) działa jako konkurencyjne inhibitory. Substancje endogenne są regulatorami metabolizmu i nazywane są antymetabolitami. Być może wiele z nich jest stosowanych w leczeniu chorób onkologicznych i mikrobiologicznych. hamują kluczowe reakcje metaboliczne mikroorganizmów (sulfonamidy) i komórek nowotworowych. Ale przy nadmiarze substratu i niskim stężeniu konkurencyjnego inhibitora jego działanie jest anulowane.
Drugi rodzaj inhibitorów jest niekompetycyjny. Oddziałują z enzymem poza miejscem aktywnym, a nadmiar substratu nie wpływa na ich zdolność hamowania, jak ma to miejsce w przypadku inhibitorów kompetycyjnych. Inhibitory te oddziałują albo z pewnymi grupami enzymu (metale ciężkie wiążą się z grupami tiolowymi Cys), albo najczęściej z centrum regulatorowym, co zmniejsza zdolność wiązania centrum aktywnego. Właściwy proces hamowania polega na całkowitym lub częściowym stłumieniu aktywności enzymu przy zachowaniu jego pierwotnej i przestrzennej struktury.
Istnieje również odwracalne i nieodwracalne hamowanie. Nieodwracalne inhibitory dezaktywują enzym, tworząc wiązanie chemiczne z jego AA lub innymi składnikami strukturalnymi. Zwykle jest to wiązanie kowalencyjne z jednym z miejsc centrum aktywnego. Taki kompleks praktycznie nie dysocjuje w warunkach fizjologicznych. W innym przypadku inhibitor zaburza strukturę konformacyjną cząsteczki enzymu – powodując jej denaturację.
Działanie odwracalnych inhibitorów można zniwelować nadmiarem substratu lub działaniem substancji zmieniających strukturę chemiczną inhibitora. Kompetycyjne i niekonkurencyjne inhibitory są w większości przypadków odwracalne.
Oprócz inhibitorów znane są również aktywatory katalizy enzymatycznej. Oni:
1)
chronić cząsteczkę enzymu przed działaniem inaktywującym,
2)
tworzą kompleks z substratem, który bardziej aktywnie wiąże się z centrum aktywnym F,
3)
oddziałując z enzymem o strukturze czwartorzędowej, rozdzielają jego podjednostki i tym samym otwierają dostęp substratu do centrum aktywnego.
Dystrybucja enzymów w organizmie
Enzymy biorące udział w syntezie białek, kwasów nukleinowych i enzymów metabolizmu energetycznego są obecne we wszystkich komórkach organizmu. Ale komórki pełniące specjalne funkcje zawierają również specjalne enzymy. Tak więc komórki wysepek Langerhansa w trzustce zawierają enzymy, które katalizują syntezę hormonów insuliny i glukagonu. Enzymy charakterystyczne tylko dla komórek niektórych narządów nazywane są specyficznymi dla narządu: arginaza i urokinaza- wątroba, kwaśna fosfataza- prostata. Zmieniając stężenie takich enzymów we krwi, ocenia się obecność patologii w tych narządach.
W komórce poszczególne enzymy są rozmieszczone w cytoplazmie, inne są osadzone w błonach mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego, takie enzymy tworzą przegródki,
w którym zachodzą pewne, ściśle ze sobą powiązane etapy metabolizmu.
Wiele enzymów powstaje w komórkach i jest wydzielanych do jam anatomicznych w stanie nieaktywnym - są to proenzymy. Często w postaci proenzymów powstają enzymy proteolityczne (rozkładające białka). Następnie pod wpływem pH lub innych enzymów i substratów następuje ich modyfikacja chemiczna i centrum aktywne staje się dostępne dla substratów.
Istnieje również izoenzymy
- enzymy, które różnią się budową molekularną, ale pełnią tę samą funkcję.
Nomenklatura i klasyfikacja enzymów
Nazwa enzymu jest utworzona z następujących części:
1.
nazwa podłoża, z którym oddziałuje
2.
charakter katalizowanej reakcji
3.
nazwa klasy enzymu (ale jest to opcjonalne)
4. sufiks -aza-
pirogronian - dekarboksyl - aza, bursztynian - dewodór - aza
Ponieważ znanych jest już około 3 tysięcy enzymów, należy je sklasyfikować. Obecnie przyjęto międzynarodową klasyfikację enzymów, która opiera się na rodzaju katalizowanej reakcji. Istnieje 6 klas, które z kolei dzielą się na szereg podklas (w tej książce są one przedstawione tylko wybiórczo):
1.
oksydoreduktazy.
Katalizuj reakcje redoks. Są one podzielone na 17 podklas. Wszystkie enzymy zawierają część niebiałkową w postaci hemu lub pochodnych witamin B 2, B 5. Podlegający utlenianiu substrat działa jako donor wodoru.
1.1.
Dehydrogenazy usuwają wodór z jednego substratu i przenoszą go na inne substraty. Koenzymy NAD, NADP, FAD, FMN. Przyjmują odcięty przez enzym wodór, zamieniając się w formę zredukowaną (NADH, NADPH, FADH) i przenoszą go do innego kompleksu enzym-substrat, gdzie jest oddawany.
1.2.
Oksydaza - katalizuje przeniesienie wodoru do tlenu z utworzeniem wody lub H 2 O 2. F. Cytochromoksydazałańcuch oddechowy.
RH + NAD H + O 2 = ROH + NAD + H 2 O
1.3.
Monooksydazy - cytochrom P450. Zgodnie ze swoją strukturą, zarówno hemo-, jak i flawoproteina. Hydroksyluje lipofilowe ksenobiotyki (według mechanizmu opisanego powyżej).
1.4.
peroksydazyI katalaza- katalizują rozkład nadtlenku wodoru, który powstaje podczas reakcji metabolicznych.
1.5.
Oksygenazy - katalizują reakcje dodawania tlenu do podłoża.
2.
Transferazy
- katalizują przeniesienie różnych rodników z cząsteczki donorowej na cząsteczkę akceptorową.
A A+ mi + b = mi A+ ZA + B = E + B A+ A
2.1.
metylotransferaza (CH3-).
2.2 Karboksylo- i karbamoilotransferazy.
2.2.
Acylotransferazy - Koenzym A (przeniesienie grupy acylowej - RC=O).
Przykład: synteza neuroprzekaźnika acetylocholiny (patrz rozdział „Metabolizm białek”).
2.3.
Transferazy heksozylowe katalizują przenoszenie reszt glikozylowych.
Przykład: rozszczepienie cząsteczki glukozy z glikogenu pod działaniem fosforylaza.
2.4.
Aminotransferazy - przenoszenie grup aminowych
R 1- CO - R 2 + R 1 - CH - NH 3
- R 2 \u003d R 1 - CH - NH 3
- R2 + R1 - CO - R2
Odgrywają ważną rolę w przemianie AK. Powszechnym koenzymem jest fosforan pirydoksalu.
Przykład: aminotransferaza alaninowa(AlAT): pirogronian + glutaminian = alanina + alfa-ketoglutaran (patrz rozdział „Metabolizm białek”).
2.5.
Fosfotransfereza (kinaza) - katalizuje przeniesienie reszty kwasu fosforowego. W większości przypadków donorem fosforanów jest ATP. Enzymy tej klasy biorą udział głównie w procesie rozkładu glukozy.
Przykład: Kinaza hekso (gluko)..
3.
Hydrolazy
- katalizują reakcje hydrolizy, tj. rozszczepienie substancji z dodatkiem w miejscu zerwania wiązania wody. Ta klasa obejmuje głównie enzymy trawienne, są one jednoskładnikowe (nie zawierają części niebiałkowej)
R1-R2 + H2O \u003d R1H + R2OH
3.1.
Esterazy - rozkładają niezbędne wiązania. Jest to duża podklasa enzymów, które katalizują hydrolizę estrów tiolowych, fosfoestrów.
Przykład: NH2).
Przykład: arginaza(cykl mocznikowy).
4. Liasy
- katalizują reakcje rozszczepienia cząsteczek bez dodatku wody. Enzymy te mają część niebiałkową w postaci pirofosforanu tiaminy (B 1) i fosforanu pirydoksalu (B 6).
4.1.
Liazy wiązań C-C. Są one powszechnie określane jako dekarboksylazy.
Przykład: dekarboksylaza pirogronianowa.
5.Izomerazy
- katalizują reakcje izomeryzacji.
Przykład: izomeraza fosfopentozy, izomeraza pentozofosforanowa(enzymy nieutleniającej gałęzi szlaku pentozofosforanowego).
6. Ligazy
katalizują syntezę bardziej złożonych substancji z prostych. Takie reakcje przebiegają z wydatkowaniem energii ATP. Do nazwy takich enzymów dodaje się syntetazę.
LITERATURA DO ROZDZIAŁU IV.3.
1. Byshevsky A. Sh., Tersenov O. A. Biochemia dla lekarza // Ekaterinburg: Ural worker, 1994, 384 s.;
2. Knorre D.G., Myzina SD. Chemia biologiczna. - M.: Wyżej. szkoła 1998, 479 s.;
3. Filippovich Yu. B., Egorova T. A., Sevastyanova G. A. Warsztaty z biochemii ogólnej // M.: Prosveschenie, 1982, 311 s.;
4. Lehninger A. Biochemia. Molekularne podstawy budowy i funkcji komórki // M.: Mir, 1974, 956 s.;
5. Pustovalova L.M. Warsztaty z biochemii // Rostów nad Donem: Phoenix, 1999, 540 s.
Mechanizm działania enzymów
Mechanizm działania enzymów można rozpatrywać z dwóch punktów widzenia: z punktu widzenia zmian energii reakcji chemicznych oraz z punktu widzenia zdarzeń w centrum aktywnym.
A. Przemiany energii w reakcjach chemicznych
Wszelkie reakcje chemiczne przebiegają zgodnie z dwoma podstawowymi prawami termodynamiki: prawem zachowania energii i prawem entropii. Zgodnie z tymi prawami całkowita energia układu chemicznego i jego otoczenia pozostaje stała, podczas gdy układ chemiczny ma tendencję do zmniejszania porządku (zwiększania entropii). Aby zrozumieć energię reakcji chemicznej, nie wystarczy znać bilans energetyczny reagentów wchodzących i wychodzących z reakcji, konieczne jest uwzględnienie zmian energii w przebiegu danej reakcji chemicznej oraz roli enzymów w dynamice tego procesu. Rozważ reakcję rozkładu kwasu węglowego:
H2CO3 > H20 + C02.
Kwas węglowy jest słaby; reakcja jego rozkładu będzie przebiegać w normalnych warunkach, jeśli cząsteczki kwasu węglowego mają energię przekraczającą pewien poziom, zwany energią aktywacji E a (ryc. 2-10).
Energia aktywacji to dodatkowa energia kinetyczna potrzebna cząsteczkom substancji do reakcji.
Po osiągnięciu tej bariery energetycznej w cząsteczce zachodzą zmiany, które powodują redystrybucję wiązań chemicznych i powstawanie nowych związków. O cząsteczkach z E a mówi się, że znajdują się w stanie przejściowym. Różnica energii między początkowym odczynnikiem H 2 CO 3 a końcowymi związkami H 2 O i CO 2 nazywana jest zmianą swobodnego
Ryż. 2-10. Zmiana energii swobodnej podczas rozkładu kwasu węglowego.
Energie reakcji DG. Cząsteczki H 2 O i CO 2 są bardziej stabilnymi substancjami niż H 2 CO 3 , tj. mają mniej energii i praktycznie nie reagują w normalnych warunkach. Uwolniona w wyniku tej reakcji energia jest rozpraszana w postaci ciepła do otoczenia.
Im więcej cząsteczek ma energię przekraczającą poziom E a, tym większa jest szybkość reakcji chemicznej. Szybkość reakcji chemicznej można zwiększyć przez ogrzewanie. Zwiększa to energię reagujących cząsteczek. Jednak wysokie temperatury są szkodliwe dla żywych organizmów, dlatego w komórce stosuje się enzymy, które przyspieszają reakcje chemiczne. Enzymy zapewniają wysoką szybkość reakcji w optymalnych warunkach panujących w komórce, poprzez obniżenie poziomu Ea. W ten sposób enzymy obniżają wysokość bariery energetycznej, w wyniku czego zwiększa się liczba cząsteczek reaktywnych, a zatem zwiększa się szybkość reakcji.
W mechanizmie katalizy enzymatycznej decydujące znaczenie ma powstawanie nietrwałych półproduktów - kompleksu enzym-substrat ES, który ulega przemianie w niestabilny kompleks przejściowy EP, który niemal natychmiast rozkłada się na wolny enzym i produkt reakcji.
Zatem katalizatory biologiczne (enzymy) nie zmieniają energii swobodnej
substratów i produktów, a zatem nie zmieniają równowagi reakcji (ryc. 2-11).
Enzym, działając jako katalizator reakcji chemicznej, podlega ogólnym prawom katalizy i posiada wszystkie właściwości charakterystyczne dla katalizatorów niebiologicznych, jednak posiada również charakterystyczne właściwości związane z cechami strukturalnymi enzymów.
Enzymy są podobne do katalizatorów niebiologicznych w tym, że:
- Enzymy katalizują reakcje możliwe energetycznie;
- energia układu chemicznego pozostaje stała;
- podczas katalizy kierunek reakcji nie zmienia się;
- Enzymy nie są zużywane podczas reakcji.
Różnice między enzymami a katalizatorami niebiologicznymi polegają na tym, że:
- · szybkość reakcji enzymatycznych jest większa niż reakcji katalizowanych katalizatorami niebiałkowymi;
- Enzymy mają wysoką specyficzność;
- W komórce zachodzi reakcja enzymatyczna, tj. w temperaturze 37°C, przy stałym ciśnieniu atmosferycznym i fizjologicznym pH;
- Szybkość reakcji enzymatycznej można regulować.
1. Tworzenie kompleksu enzym-substrat
Fakt, że enzymy mają wysoką specyficzność, umożliwił w 1890 r. postawienie hipotezy, zgodnie z którą centrum aktywne enzymu jest komplementarne do substratu, tj. odpowiada mu jako „klucz do zamka”. Po interakcji substratu („klucza”) z centrum aktywnym („zamek”) zachodzą przemiany chemiczne substratu w produkt. Centrum aktywne uznano za stabilną, sztywno określoną strukturę.
W 1959 roku zaproponowano inny wariant hipotezy „zamka na klucz”, aby wyjaśnić zdarzenia w miejscu aktywnym enzymu. Zgodnie z tą hipotezą ośrodek aktywny jest strukturą elastyczną
Ryż. 2-11. Zmiana energii swobodnej podczas reakcji chemicznej niekatalizowanej i katalizowanej przez enzymy.
Enzym obniża energię aktywacji E a, tj. zmniejsza wysokość bariery energetycznej, w wyniku czego zwiększa się udział cząsteczek reaktywnych, a zatem zwiększa się szybkość reakcji w stosunku do podłoża. Substrat, oddziałując z centrum aktywnym enzymu, powoduje zmianę jego konformacji, prowadząc do powstania korzystnego dla chemicznych modyfikacji substratu kompleksu enzym-substrat. W tym przypadku cząsteczka substratu zmienia również swoją konformację, co zapewnia wyższą wydajność reakcji enzymatycznej. Ta „hipoteza indukowanego dopasowania” została następnie potwierdzona eksperymentalnie.
2. Sekwencja zdarzeń podczas katalizy enzymatycznej
Proces katalizy enzymatycznej można warunkowo podzielić na następujące etapy (ryc. 2-12). reakcja chemiczna katalizy substratowej
Pierwszy, drugi i czwarty etap katalizy są krótkie i zależą od stężenia substratu (dla pierwszego etapu) oraz stałych wiązania ligandu w miejscu aktywnym enzymu (dla pierwszego i trzeciego etapu). Zmiany energii reakcji chemicznej na tych etapach są nieznaczne.
Trzeci etap jest najwolniejszy; jego czas trwania zależy od energii aktywacji reakcji chemicznej. Na tym etapie wiązania są rozrywane w cząsteczce substratu, powstają nowe wiązania i powstaje cząsteczka produktu.
3. Rola miejsca aktywnego w katalizie enzymatycznej
W wyniku badań wykazano, że cząsteczka enzymu z reguły jest wielokrotnie większa niż cząsteczka substratu ulegająca przemianie chemicznej przez ten enzym. Tylko niewielka część cząsteczki enzymu wchodzi w kontakt z substratem, zwykle od 5 do 10 reszt aminokwasowych, które tworzą miejsce aktywne enzymu. Rolą pozostałych reszt aminokwasowych jest zapewnienie prawidłowej konformacji cząsteczki enzymu dla optymalnego przebiegu reakcji chemicznej.
Miejsce aktywne na wszystkich etapach katalizy enzymatycznej nie może być uważane za pasywne miejsce wiązania substratu. Jest to złożona „maszyna” molekularna, która wykorzystuje różnorodne mechanizmy chemiczne do promowania przekształcenia substratu w produkt.
W centrum aktywnym enzymu substraty są ułożone w taki sposób, że grupy funkcyjne substratów biorących udział w reakcji znajdują się blisko siebie. Ta właściwość centrum aktywnego nazywana jest efektem zbliżania się i orientacji reagentów. Tak uporządkowany układ substratów powoduje spadek entropii, aw konsekwencji spadek energii aktywacji (E a), która decyduje o wydajności katalitycznej enzymów.
Centrum aktywne enzymu przyczynia się również do destabilizacji wiązań międzyatomowych w cząsteczce substratu, co ułatwia przebieg reakcji chemicznej i powstawanie produktów. Ta właściwość miejsca aktywnego nazywana jest efektem deformacji podłoża (ryc. 2-12).
Ryż. 2-12. Etapy katalizy enzymatycznej.
I - etap zbliżania i orientacji substratu względem centrum aktywnego enzymu; II - tworzenie kompleksu enzym-substrat (ES) w wyniku indukowanej podatności; III - deformacja substratu i tworzenie niestabilnego kompleksu enzym-produkt (EP); IV- rozpad kompleksu (EP) z uwolnieniem produktów reakcji z centrum aktywnego enzymu i uwolnieniem enzymu.
B. Molekularne mechanizmy katalizy enzymatycznej
O mechanizmach katalizy enzymatycznej decyduje rola grup funkcyjnych centrum aktywnego enzymu w reakcji chemicznej przemiany substratu w produkt. Istnieją 2 główne mechanizmy katalizy enzymatycznej: kataliza kwasowo-zasadowa i kataliza kowalencyjna.
1. Kataliza kwasowo-zasadowa
Pojęcie katalizy kwasowo-zasadowej wyjaśnia aktywność enzymatyczną udziałem grup kwasowych (donorów protonów) i/lub grup zasadowych (akceptorów protonów) w reakcji chemicznej. Kataliza kwasowo-zasadowa jest powszechnym zjawiskiem. Reszty aminokwasowe tworzące centrum aktywne mają grupy funkcyjne, które wykazują właściwości zarówno kwasów, jak i zasad.
Aminokwasy biorące udział w katalizie kwasowo-zasadowej obejmują przede wszystkim Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp i His. Rodniki tych aminokwasów w formie protonowanej są kwasami (donorami protonów), w formie deprotonowanej są to zasady (akceptory protonów). Dzięki tej właściwości grup funkcyjnych miejsca aktywnego enzymy stają się unikalnymi katalizatorami biologicznymi, w przeciwieństwie do katalizatorów niebiologicznych, które mogą wykazywać właściwości kwasowe lub zasadowe.
Przykładem katalizy kwasowo-zasadowej, w której kofaktorami są jony Zn 2+, a koenzymem jest cząsteczka NAD+, jest enzym wątrobowej dehydrogenazy alkoholowej, który katalizuje reakcję utleniania alkoholu (ryc. 2-13):
C2H5OH + NAD + > CH3-SON + NADH + H
2. Kataliza kowalencyjna
Kataliza kowalencyjna polega na ataku grup nukleofilowych (ujemnie naładowanych) lub elektrofilowych (dodatnio naładowanych) centrum aktywnego enzymu przez cząsteczki substratu z utworzeniem wiązania kowalencyjnego między substratem a koenzymem lub grupą funkcyjną amino reszta kwasowa (zwykle jedna) centrum aktywnego enzymu.
Działanie proteaz serynowych, takich jak trypsyna, chymotrypsyna i trombina, jest przykładem mechanizmu katalizy kowalencyjnej, gdy między substratem a resztą aminokwasową serynową miejsca aktywnego enzymu tworzy się wiązanie kowalencyjne. Określenie „proteazy serynowe” wynika z faktu, że reszta aminokwasowa seryny jest częścią centrum aktywnego wszystkich tych enzymów i bierze bezpośredni udział w katalizie. Rozważmy mechanizm katalizy kowalencyjnej na przykładzie chymotrypsyny, która hydrolizuje wiązania peptydowe podczas trawienia białek w dwunastnicy (patrz rozdział 9). Substratami chymotrypsyny są peptydy zawierające aminokwasy aromatyczne i cykliczne
Ryż. 2-13. Mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej na przykładzie wątrobowej dehydrogenazy alkoholowej.
I - cząsteczka etanolu ma centrum wiążące, które zapewnia oddziaływanie hydrofobowe między centrum aktywnym a grupą metylową alkoholu; II - dodatnio naładowany atom cynku przyczynia się do eliminacji protonu z grupy alkoholowej etanolu z utworzeniem ujemnie naładowanego atomu tlenu. Ujemny ładunek jest redystrybuowany między atomem tlenu i sąsiednim atomem wodoru, który jest następnie przenoszony w postaci hydrationu na czwarty atom węgla koenzymu nikotynamidu NAD+; III - w efekcie powstają zredukowane formy NADH i aldehyd octowy.
Rodniki hydrofobowe (Phen, Tyr, Tri), co wskazuje na udział sił hydrofobowych w tworzeniu kompleksu enzym-substrat. Mechanizm katalizy kowalencyjnej chymotrypsyny przedstawiono na ryc. 2-14.
Rodniki Asp 102, Gis 57 i Ser 195 biorą bezpośredni udział w akcie katalizy. Na skutek nukleofilowego ataku wiązania peptydowego substratu, wiązanie to zostaje zerwane z wytworzeniem kowalencyjnie zmodyfikowanej seryny - acylo-chymotrypsyny. Kolejny fragment peptydu jest uwalniany w wyniku zerwania wiązania wodorowego między fragmentem peptydu a His57 miejsca aktywnego chymotrypsyny. Ostatnim etapem hydrolizy wiązania peptydowego białek jest deacylacja chymotrypsyny w obecności cząsteczki wody z uwolnieniem drugiego fragmentu hydrolizowalnego białka i początkowej formy enzymu.
enzym kataliza biologiczna transaminacja
Odkrycie struktury przestrzennej wielu enzymów za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej dostarczyło wiarygodnych podstaw do skonstruowania racjonalnych schematów mechanizmu ich działania.
Ustalenie mechanizmu działania enzymów ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia zależności strukturalnych i funkcjonalnych w różnych układach biologicznie czynnych.
Lizozym występuje w różnych tkankach zwierząt i roślin, w szczególności w płynie łzowym i białku jaja. Lizozym działa jako środek przeciwbakteryjny poprzez katalizowanie hydrolizy ścian komórkowych wielu bakterii. Ten polisacharyd jest utworzony przez naprzemienne reszty kwasu N-acetylomuranowego (NAM) połączone wiązaniem 1,4-glikozydowym (łańcuchy polisacharydowe są usieciowane krótkimi fragmentami peptydowymi).
Polisacharyd bakteryjny jest bardzo złożonym związkiem nierozpuszczalnym, dlatego jako substraty lizozymu często stosuje się dobrze hydrolizujące oligosacharydy utworzone przez reszty NAG.
Lizozym białka jaja kurzego składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego zawierającego 129 reszt aminokwasowych; jego masa cząsteczkowa wynosi 14 600. Wysoką stabilność enzymu zapewnia obecność czterech mostków dwusiarczkowych.
Informacje o centrum aktywnym i rodzaju procesu katalitycznego uzyskał D. Philips w 1965 roku. na podstawie badań dyfrakcji rentgenowskiej lizozymu i jego kompleksów z inhibitorami. Cząsteczka lizozymu ma kształt elipsoidy o osiach 4,5*3*3 nm; pomiędzy dwiema połówkami cząsteczki znajduje się „luka”, w której zachodzi wiązanie oligosacharydów. Ściany szczeliny tworzą głównie łańcuchy boczne aminokwasów niepolarnych, które zapewniają wiązanie niepolarnych cząsteczek substratu, a także zawierają łańcuchy boczne aminokwasów polarnych, które są zdolne do tworzenia wiązań wodorowych z grupami acyloaminowymi i hydroksylowymi substratu. Wielkość przerwy pozwala na umieszczenie cząsteczki oligosacharydu zawierającej 6 reszt monosacharydowych. Nie jest możliwe ustalenie charakteru wiązania substratu, na przykład heksasacharydu NAG6, metodą analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Jednocześnie kompleksy enzymu z inhibitorem trisacharydu NAG 3 są stabilne i dobrze przebadane. NAG 3 wiąże się w szczelinie na powierzchni enzymu, tworząc wiązania wodorowe i kontakty van der Waalsa; jednocześnie wypełnia tylko połowę luki, w której mogą się związać jeszcze trzy reszty monosacharydowe. Koniec nieredukujący (cukier A) znajduje się na początku przerwy, a koniec redukujący (cukier C) w jej środkowej części; reszty cukrowe A, B i C mają konformację krzesła. Konstrukcję modelu kompleksu enzym-substrat oparto na założeniu, że przy wiązaniu substratu NAG 6 zachodzą takie same oddziaływania jak przy wiązaniu NAG 3 . W modelu enzymatycznym wewnątrz przerwy umieszczono trzy reszty cukrowe (określane jako reszty D, E i F); każdy kolejny cukier był przyłączany w taki sposób, że jego konformacja była taka sama (na ile to możliwe) jak pierwszych trzech cukrów. Jako część kompleksu modelowego, wszystkie reszty cukrowe realizują efektywne niekowalencyjne interakcje z bocznymi i peptydowymi grupami reszt aminokwasowych, które tworzą lukę.
Identyfikując grupy katalityczne, naturalne było skupienie się na tych, które znajdują się w kompleksie enzym-substrat w pobliżu rozszczepialnego wiązania glikozydowego i mogą służyć jako donory lub akceptory protonów. Okazało się, że po jednej stronie rozszczepionego wiązania, w pewnej odległości? 0,3 nm (od tlenu wiązania glikozydowego) znajduje się grupa karboksylowa Glu-35, a z drugiej (w tej samej odległości) grupa karboksylowa Asp-52, ich środowisko jest bardzo różne. Glu-35 jest otoczony resztami hydrofobowymi; można przyjąć, że przy optymalnym pH enzymu grupa ta jest w stanie niezjonizowanym. Środowisko Asp-52 jest wyraźnie polarne; jego grupa karboksylowa uczestniczy jako akceptor wodoru w złożonej sieci wiązań wodorowych i prawdopodobnie działa w stanie zjonizowanym.
Zaproponowano następujący schemat procesu katalitycznego podczas hydrolizy oligosacharydu. Niezjonizowana grupa karboksylowa Glu-35 działa jako donor protonów, dostarczając ją do glikozydowego atomu tlenu między atomem C (1) cukru D a atomem C (4) cukru E (ogólny etap katalizy kwasowej); powoduje to zerwanie wiązania glikozydowego. W efekcie reszta cukrowa D przechodzi w stan karbokationu z dodatnio naładowanym atomem węgla C (1) i przyjmuje konformację półkrzesła. Ujemny ładunek grupy karboksylanowej Asp-52 stabilizuje karbokation. Pozostała część NAG 2 (cukry E+F) dyfunduje z regionu miejsca aktywnego. Następnie do reakcji wchodzi cząsteczka wody; jego proton przechodzi do Glu-35, a grupa OH - do atomu C(1) reszty D (etap katalizy zasadowej). Reszta NAG 4 (cukry A + B + C + D) opuszcza obszar centrum aktywnego, a enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Rybonukleaza (RNaza) bydlęcej trzustki hydrolizuje wiązania międzynukleotydowe w RNA w pobliżu jednostek pirymyliny, które pozostają zestryfikowane w pozycji 3". Enzym ten, wraz z innymi nukleazami, jest szeroko stosowany w analizie struktury RNA.
RNaza składa się z jednego łańcucha polipeptydowego zawierającego 124 reszty aminokwasowe, a jej masa cząsteczkowa wynosi 13 680; W cząsteczce znajdują się cztery wiązania dwusiarczkowe. RNaza jest pierwszym enzymem, dla którego ustalono strukturę pierwszorzędową.
Opierając się na wynikach badań renaturacji rybonukleazy, K. Afinsen po raz pierwszy jasno sformułował ideę, że struktura przestrzenna białka jest zdeterminowana przez jego strukturę pierwszorzędową.
W 1958 roku F. Richards wykazał, że w pewnych warunkach subtilizyna rozszczepia wiązanie peptydowe Ala-20 - Ser-21 w RNazie. Otrzymane fragmenty nazwano peptydem S (reszty 1-20) i białkiem S (reszty 21-124); dzięki oddziaływaniom niekowalencyjnym fragmenty tworzą kompleks zwany RNazą S. Kompleks ten ma prawie pełną aktywność katalityczną natywnego enzymu; w postaci wyizolowanej peptyd S i białko S są nieaktywne. Ponadto stwierdzono, że syntetyczny peptyd identyczny w sekwencji z fragmentem peptydu S zawierającym reszty 1 do 13 przywraca aktywność białka S, ale krótszy peptyd zawierający reszty 1 do 11 nie ma takiej zdolności. Uzyskane dane pozwoliły nam stwierdzić, że odpowiednie reszty His-12 lub Met-13 (lub obie te reszty) są zawarte w miejscu aktywnym enzymu.
Badając wpływ pH na aktywność RNazy, wyjaśniono ważną rolę grup funkcyjnych białek o pK 5,2 i 6,8; sugerowało to udział reszt histydyny w procesie katalitycznym.
Po karboksylacji RNazy jodooctanem przy pH 5,5, tj. w warunkach, w których zachodzi głównie modyfikacja reszt histydyny, obserwowano całkowitą utratę aktywności; zmodyfikowany enzym zawiera 1 mol grup karboksymetylowych na 1 mol białka. W rezultacie powstają dwie formy monokarboksymetylenowe enzymu. W jednej postaci His-12 jest karboksymetylowany, aw drugiej His-119. His-119 został w większości zmodyfikowany.
Dane te sugerują, że His-12 i His-119 znajdują się w miejscu aktywnym i że modyfikacja jednego z nich zapobiega modyfikacji drugiego.
W wyniku badań dyfrakcji rentgenowskiej wyjaśniono budowę przestrzenną RNazy S oraz kompleksu RNazy S z inhibitorami. Cząsteczka ma kształt nerki, centrum aktywne zlokalizowane jest w zagłębieniu, w którym znajdują się pozostałości His-12, His-119 i Lys-41.
Hydroliza zachodzi w wyniku sprzężonego działania reszt His-12 i His-119, które przeprowadzają katalizę kwasowo-zasadową. Poniższy schemat przedstawia etapy procesu katalitycznego:
1. Substrat znajduje się w miejscu aktywnym; His-12, His-119 i Lys-41 znajdują się w pobliżu ujemnie naładowanego fosforanu.
2. W wyniku działania His-12 jako zasady przyjmującej proton z grupy 2"-OH rybozy oraz His-119 jako kwasu oddającego proton atomowi tlenu fosforanu, powstaje związek pośredni najpierw tworzy się kompleks, a następnie 2", 3"-cykliczny fosforan.
3. W miejsce odchodzącego produktu wchodzi woda, oddając proton His-119 i OH do fosforanu, w tym samym czasie proton z His-12 przechodzi do atomu tlenu rybozy, powstaje drugi produkt i enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Chymotrypsyna jest wydzielana w postaci proenzymu - chymotrypsynogenu przez trzustkę kręgowców; aktywacja proenzymu zachodzi w dwunastnicy pod wpływem trypsyny. Fizjologiczną funkcją chymotrypsyny jest hydroliza białek i polipeptydów. Chymotrypsyna atakuje głównie wiązania peptydowe utworzone przez reszty karboksylowe tyrozyny, tryptofanu, cenylalaniny i metionaniny. Skutecznie hydrolizuje również estry odpowiednich aminokwasów. Masa cząsteczkowa chymotrypsyny wynosi 25 000, cząsteczka zawiera 241 reszt aminokwasowych. Chymotrypsyna składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami dwusiarczkowymi.
Grupy funkcyjne miejsca aktywnego chymotrypsyny zidentyfikowano za pomocą nieodwracalnych inhibitorów. Resztę Ser-195 zmodyfikowano fluorofosforanem diizopropylu i fenylometylosulfofluorkiem, a resztę His-122 zmodyfikowano ketonem N-tosylo-L-fenyloalaniny chlorometylu. Dwuetapowy proces hydrolizy chymotrypsyny odkryto w badaniu kinetyki hydrolizy octanu p-nitrofenylu.
Cechą charakterystyczną rozważanego procesu jest powstawanie kowalencyjnego związku pośredniego, enzymu acylowego. Acylowaną grupę katalityczną zidentyfikowano jako resztę Ser-195. Mechanizm katalizy przeprowadzanej przez enzym został zaproponowany jeszcze przed ustaleniem struktury przestrzennej białka, ale później został dopracowany. W szczególności badania z użyciem 18 H 2 O umożliwiły udowodnienie powstawania enzymu acylowego podczas hydrolizy peptydów.
Trójwymiarową strukturę o rozdzielczości 0,2 nm ustalono za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej D. Blowa. w 1976 roku Cząsteczka ma kształt elipsoidy o osiach 5,4*4*4 nm. Wyniki badań krystalograficznych potwierdziły przypuszczenie, że reszty Ser-195 i His-57 są zbliżone. Grupa hydroksylowa Ser-195 znajduje się w odległości ~ 0,3 nm na północ od atomu azotu pierścienia imidazolu His-57. Najbardziej interesującym faktem było to, że atom azotu w pozycji 1 pierścienia znajduje się w odległości ~0,28 nm od atomu tlenu grupy karboksylowej łańcucha bocznego Asp-102 i zajmuje pozycję sprzyjającą powstawaniu wodoru obligacja.
Należy zaznaczyć, że badania chemiczne nie wykazały udziału Asp-102 w funkcjonowaniu centrum aktywnego, ponieważ pozostałość ta jest osadzona głęboko w cząsteczce.
Obecnie uważa się, że trzy reszty Asp-102, His-57 i Ser-195 tworzą system przenoszenia ładunku, który odgrywa kluczową rolę w procesie katalizy. Funkcjonowanie układu zapewnia efektywny udział His-57 w katalizie jako katalizatora kwasowo-zasadowego oraz zwiększa reaktywność Ser-195 do węgla karboksylowego atakowanego wiązania.
Kluczowym elementem katalizy jest przeniesienie protonu z Ser-195 do His-57. W tym samym czasie atom tlenu seryny atakuje karbonylowy atom węgla substratu, tworząc najpierw pośredni związek tetraedryczny (1), a następnie enzym acylowy (2). Kolejnym etapem jest deacylacja. Cząsteczka wody wchodzi do układu przenoszenia ładunku, a jon OH jednocześnie atakuje karbonylowy atom węgla grupy acylowej enzymu acylowego. Podobnie jak w etapie acylowania, powstaje pośredni związek tetraedryczny (4). His-57 przekazuje następnie proton atomowi tlenu Ser-195, uwalniając produkt acylowy; dyfunduje do roztworu, a enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Karboksypeptydaza A jest wydzielana jako proenzym przez trzustkę kręgowców. Tworzenie aktywnego enzymu zachodzi w jelicie cienkim przy udziale chymotrypsyny. Enzym sekwencyjnie odcina C-końcowe reszty aminokwasowe z łańcucha peptydowego, tj. jest egzopeptydazą.
Karboksypeptydaza A jest utworzona przez pojedynczy łańcuch polipeptydowy zawierający 307 reszt aminokwasowych; masa cząsteczkowa wynosi 34 470. Sekwencję aminokwasową białka ustalił w 1969 r. R. Bredshaw.
Wyjaśnienie mechanizmu działania enzymu było możliwe dopiero po przeprowadzeniu badań dyfrakcji rentgenowskiej. Strukturę przestrzenną enzymu i jego kompleksu z dipeptydem Gly-Tyr (model substratowy) ustalił W. Lipscomb. Cząsteczka enzymu ma kształt elipsoidy o osiach 5,0*4,2*3,8 nm; centrum aktywne znajduje się w zagłębieniu przechodzącym w głęboką kieszeń niepolarną. W strefie centrum aktywnego zlokalizowany jest jon cynku (jego ligandami są łańcuchy boczne reszt Glu-72, His196, His-69 i cząsteczka wody), a także grupy funkcyjne zaangażowane w wiązanie substratu i katalizę - Arg-145, Glu-270 i Tyr-248.
Analiza porównawcza struktury enzymu i jego kompleksu z Gly-Tyr dostarczyła ważnych informacji na temat struktury kompleksu enzym-substrat. W szczególności stwierdzono, że podczas tworzenia kompleksu grupa hydroksylowa Tyr-248 przesuwa się o 1,2 nm względem swojej pozycji w wolnym enzymie (tj. o około 1/3 średnicy cząsteczki).
Zgodnie ze schematem procesu katalitycznego, grupa karboksylanowa Glu-270 aktywuje cząsteczkę wody znajdującą się w sferze reakcyjnej, wyciągając z niej proton; powstały jon OH- przeprowadza atak nukleofilowy na węgiel karbonylowy rozszczepialnego wiązania. Jednocześnie grupa hydroksylowa Tyr-248, znajdująca się w pobliżu atomu azotu rozszczepialnego wiązania peptydowego, przekazuje mu proton. W rezultacie zaatakowane wiązanie peptydowe zostaje rozerwane, a powstałe produkty opuszczają strefę miejsca aktywnego. Poniższy schemat ilustruje ogólną podstawową katalizę.
Aminotransferaza asparaginianowa katalizuje odwracalną reakcję transaminacji.
Enzymatyczna reakcja transaminacji została odkryta przez A.E. Braunsteina i M.G. Kritzmana w 1937 roku w badaniu preparatu enzymatycznego z mięśnia gołębia. W kolejnych badaniach wykazano, że reakcje transaminacji są szeroko rozpowszechnione u dzikich zwierząt i odgrywają ważną rolę w sprzęganiu metabolizmu azotu i energii.
W 1945 roku stwierdzono, że pirydoksalo-5"-fosforan (PLP) jest koenzymem aminotransferaz. Cząsteczka AAT jest dimerem utworzonym z identycznych podjednostek. W mięśniu sercowym badanych kręgowców występują dwa izoenzymy - cytoplazmatyczny (cAAT0 ) i aminotransferazy mitochondrialne (mAAT).
Pierwszorzędowa struktura cAAT z mięśnia sercowego została ustalona w 1972 roku. Yu.A. Ovchinnikov i A.E. Brainsteina. Łańcuch polipeptydowy białka zawiera 412 reszt aminokwasowych; masa cząsteczkowa wynosi 46 000.
Ogólna teoria katalizy pirydoksalu została opracowana przez A.E. Braunstein i M.M. Shemyakin w latach 1952-1953, a nieco później - D.E. Metzler i E.E. Snel. Zgodnie z tą teorią katalityczne działanie enzymów pirydoksalu wynika ze zdolności grupy aldehydowej fosforanu pirydoksalu do tworzenia aldimin (zasad Schiffa) podczas interakcji z aminami, w tym aminokwasami.
W powstałym fosfopirydoksyldenoaminokwasie występuje układ sprzężonych wiązań podwójnych, wzdłuż których wypieranie elektronów z atomu węgla 6 ułatwia rozrywanie wiązań tworzonych przez ten atom.
Współczesne koncepcje dotyczące mechanizmu transaminacji enzymatycznej opracowane przez A.E. Braunstein i jego współpracownicy są rozwinięciem powyższej teorii. W stanie początkowym grupa aldehydowa fosforanu pirydoksalu tworzy wiązanie aldiminowe z grupą e-aminową reszty Lys-258 centrum aktywnego (I). Po związaniu aminokwasu tworzy się kompleks Michaelisa (II), a następnie aldimina pomiędzy fosforanem pirydoksalu i substratem (III). W wyniku kolejnych przemian poprzez stadia pośrednie (IV) i (V) powstaje oksokwas (VI). To kończy pierwszą połowę reakcji transaminacji. Powtarzanie tych samych kroków w „odwrotnym” kierunku z nowym hydroksykwasem stanowi drugą połówkę reakcji, która kończy cykl katalitycznej transaminacji.
Mioglobina i hemoglobina
Te dwa białka są często określane jako enzymy oddechowe. Ich oddziaływanie z podłożem, tlenem, zostało szczegółowo wyjaśnione, głównie na podstawie analizy dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości. Trójwymiarową strukturę mioglobiny określił J. Kendrew w 1961 r., a trójwymiarową strukturę hemoglobiny M. Perutz w 1960 r.
Cząsteczka mioglobiny ma zwarty kształt - 4,5 * 3,5 * 2,5 nm, łańcuch polipeptydowy tworzy 8 spiralnych odcinków, oznaczonych literami od A do H. Ułożony jest w wyspecjalizowany sposób wokół dużego płaskiego pierścienia hemowego zawierającego żelazo. Hem to kompleks porfiryny z żelazem.
Polarne łańcuchy hemu kwasu propionowego znajdują się na powierzchni cząsteczki, reszta hemu jest osadzona w globuli. Połączenie hemu z białkiem odbywa się dzięki wiązaniu koordynacyjnemu między atomem żelaza a atomem histydyny, zlokalizowane w helisie F; jest to tak zwana proksymalna histydyna. Inna ważna reszta histydyny, dystalna histydyna, jest zlokalizowana w kieszeni hemu w helisie E; znajduje się po przeciwnej stronie atomu żelaza w większej odległości niż proksymalna histydyna. Region pomiędzy genem żelaza a dystalną histydyną w dezoksymioglobinie jest wolny, a lipofilowa cząsteczka O2 może wiązać się z żelazem hemowym, zajmując szóstą pozycję koordynacyjną. Unikalną cechą mioglobiny, podobnie jak hemoglobiny, jest ich zdolność do odwracalnego wiązania O 2 bez utleniania hemu Fe 2+ do Fe 3+ . Jest to możliwe, ponieważ w hydrofobowej kieszeni hemowej, z której wypierana jest woda, tworzy się ośrodek o niskiej przenikalności.
Kiedy O2 jest związany z atomem żelaza, ten ostatni porusza się o około 0,06 nm i kończy w płaszczyźnie pierścienia porfiryny, tj. w korzystniejszej energetycznie pozycji. Uważa się, że ruch ten wynika z faktu, że jon Fe 2+ w deoksymioglobinie znajduje się w stanie wysokospinowym, a jego promień jest zbyt duży, aby zmieścił się w płaszczyźnie pierścienia hemu porfiryny. Kiedy O2 jest związany, jon Fe2+ przechodzi w stan niskiego pinu i jego promień maleje; teraz jon Fe 2+ może przenieść się do płaszczyzny pierścienia porfirynowego.
Hemoglobina jest głównym składnikiem czerwonych krwinek, który dostarcza tlen z płuc do tkanek i dwutlenek węgla z tkanek do płuc. Hemoglobiny różnych typów różnią się postacią kryształów, rozpuszczalnością, powinowactwem do tlenu. Wynika to z różnic w sekwencji aminokwasów białek; składnik hemu jest taki sam w hemoglobinach wszystkich gatunków kręgowców i niektórych bezkręgowców.
Hemoglobina ludzka jest tetramerem składającym się z czterech podjednostek, dwóch podjednostek b i dwóch podjednostek b, z których każda zawiera odpowiednio 141 i 146 reszt aminokwasowych. Istnieje znaczna homologia między pierwszorzędowymi strukturami podjednostek β i β, a konformacja ich łańcuchów polipeptydowych jest również podobna.
Cząsteczka hemoglobiny ma kulisty kształt o średnicy 5,5 nm. Cztery podjednostki są upakowane w czworościenny kształt.
Dane z dyfrakcji rentgenowskiej wykazały, że utlenianiu hemoglobiny towarzyszy szereg zmian. Przy niskiej rozdzielczości stwierdzono, że w tym przypadku struktura staje się bardziej zwarta (atomy Fe łańcuchów β zbliżają się do siebie o około 0,6-0,7 nm), podjednostki obracają się względem siebie, a oś drugiego rzędu o 10-15 godz. Wyniki badania w wysokiej rozdzielczości wskazują, że szczególnie istotne zmiany zachodzą w rejonie styków 6V.
Do chwili obecnej na podstawie badań dyfrakcji rentgenowskiej oraz szeregu innych podejść metodologicznych dokonano znacznego postępu w wyjaśnianiu mechanizmu działania enzymów o pożądanych właściwościach w oparciu o osiągnięcia inżynierii genetycznej. Otwiera to szerokie możliwości sprawdzenia słuszności współczesnych poglądów na temat mechanizmu działania enzymów i stworzenia fundamentalnej teorii katali enzymatycznych.
V 3 = k 3* [ F 0 ] * [ S] / km.
W tym równaniu k 3 , F 0 ], km - stałych i można je zastąpić nową stałą K*. Zatem przy niskim stężeniu substratu szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do tego stężenia.
V 3 = k* * [ S].
Zależność ta odpowiada pierwszej części wykresu 2.
2. Zależność szybkości od stężenia enzymu przejawia się przy wysokim stężeniu substratu.
S?Km.
W takim przypadku Km można pominąć i równanie przyjmuje postać:
V 3 = k 3* (([ F 0 ] * [ S]) / [ S]) = k 3* [ F 0 ] = V maks.
Zatem przy wysokim stężeniu substratu szybkość reakcji zależy od stężenia enzymu i osiąga swoją maksymalną wartość
V 3 = k 3 [ F 0 ] = V maks. ( trzecia część wykresu 2).
3. Pozwala na wyznaczenie wartości liczbowej Km pod warunkiem V 3 = V max /2. W tym przypadku równanie przyjmuje postać:
Vmax /2 = ((Vmax * [S]) / Km+ [S]), stąd wynika, że Km= [S]
Zatem Km jest liczbowo równe stężeniu substratu przy szybkości reakcji równej połowie maksimum. Km jest bardzo ważną cechą enzymu, mierzoną w molach (10 -2 - 10 -6 mol) i charakteryzuje specyficzność enzymu: im niższy Km, tym wyższa specyficzność enzymu.
Graficzny definicja stałe Michaelisa.
Wygodniej jest użyć wykresu przedstawiającego linię prostą.
Taki wykres proponuje Lineweaver - Burke (wykres podwójnych odwrotności), co odpowiada odwrotnemu równaniu Michaelisa - Mentena
Zależność szybkości reakcji enzymatycznych od obecności aktywatorów i inhibitorów
Aktywatory - substancje zwiększające szybkość reakcji enzymatycznych. Istnieją aktywatory specyficzne, które zwiększają aktywność jednego enzymu (HCl - aktywator pepsynogenu) oraz aktywatory niespecyficzne, które zwiększają aktywność wielu enzymów (jony Mg - aktywatory heksokinazy, K, Na - ATPazy i innych enzymów). Jony metali, metabolity, nukleotydy mogą służyć jako aktywatory.
Mechanizm działania aktywatorów
1. Uzupełnienie centrum aktywnego enzymu, w wyniku czego ułatwiona jest interakcja enzymu z substratem. Mechanizm ten posiadają głównie jony metali.
2. Aktywator allosteryczny oddziałuje z miejscem allosterycznym (podjednostką) enzymu, poprzez jego zmiany pośrednio zmienia strukturę centrum aktywnego i zwiększa aktywność enzymu. Metabolity reakcji enzymatycznych, ATP, mają działanie allosteryczne.
3. Mechanizm allosteryczny można połączyć ze zmianą oligomeryzmu enzymu. Pod działaniem aktywatora kilka podjednostek łączy się w formę oligomeryczną, co dramatycznie zwiększa aktywność enzymu. Na przykład izocytrynian jest aktywatorem enzymu karboksylazy acetylo-CoA.
4. Fosfolilacja - defosforylacja enzymów odnosi się do odwracalnej modyfikacji enzymów. Dodatek H 3 RO 4 najczęściej gwałtownie zwiększa aktywność enzymu. Na przykład dwa nieaktywne dimery enzymu fosforylazy łączą się z czterema cząsteczkami ATP, tworząc aktywną tetrameryczną fosforylowaną postać enzymu. Fosforylację enzymów można łączyć ze zmianą ich oligomeryczności. Przeciwnie, fosforylacja enzymu zmniejsza jego aktywność (na przykład fosforylacja enzymu syntetazy glikogenu)
5. Częściowa proteoliza (modyfikacja nieodwracalna). Dzięki temu mechanizmowi fragment cząsteczki zostaje odcięty od nieaktywnej formy enzymu (proenzymu), blokując centrum aktywne enzymu. Na przykład nieaktywny pepsynogen jest przekształcany w aktywną pepsynę przez HCL.
Inhibitory - substancje zmniejszające aktywność enzymów.
Przez specyficzność rozróżnić inhibitory swoiste i niespecyficzne
Przez odwracalność rozróżnić odwracalne i nieodwracalne inhibitory.
Przez miejsce działania istnieją inhibitory, które działają na centrum aktywne i poza centrum aktywnym.
Przez mechanizm działania rozróżnić inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne.
Konkurencyjny zahamowanie .
Inhibitory tego typu mają budowę zbliżoną do substratu. Z tego powodu inhibitory i substrat konkurują o wiązanie miejsca aktywnego enzymu. Hamowanie konkurencyjne jest hamowaniem odwracalnym Działanie inhibitora kompetycyjnego można zmniejszyć, zwiększając stężenie substratu reakcji
Przykładem hamowania kompetycyjnego jest hamowanie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, która katalizuje utlenianie kwasu dikarboksylobursztynowego, przez kwas dikarboksylomalonowy, podobny strukturą do kwasu bursztynowego.
Zasada konkurencyjnego hamowania jest szeroko stosowana w opracowywaniu leków. Na przykład preparaty sulfanilamidu mają budowę zbliżoną do struktury kwasu para-aminobenzoesowego, który jest niezbędny do wzrostu mikroorganizmów. Sulfonamidy blokują enzymy drobnoustrojów niezbędne do wchłaniania kwasu para-aminobenzoesowego. Niektóre leki przeciwnowotworowe są analogami zasad azotowych i przez to hamują syntezę kwasów nukleinowych (fluorouracyl).
Graficznie hamowanie konkurencyjne ma postać:
Niekonkurencyjny zahamowanie .
Inhibitory niekonkurencyjne nie są strukturalnie podobne do substratów reakcji i dlatego nie mogą być wyparte przy wysokich stężeniach substratu. Istnieje kilka opcji działania niekonkurencyjnych inhibitorów:
1. Zablokowanie grupy funkcyjnej centrum aktywnego enzymu iw rezultacie spadek aktywności. Na przykład aktywność grup SH - może wiązać trucizny tiolowe odwracalnie (sole metali, rtęć, ołów) i nieodwracalnie (monojodooctan). Hamujące działanie inhibitorów tiolowych można zmniejszyć przez wprowadzenie dodatkowych substancji bogatych w grupy SH (np. unitiolu). Istnieją i są stosowane inhibitory serynowe, które blokują grupy OH - centrum aktywnego enzymów. Takie działanie mają organiczne substancje zawierające fosfofluor. Substancje te mogą w szczególności hamować grupy OH w enzymie acetylocholinoesterazy, który niszczy neuroprzekaźnik acetylocholinę.
2. Blokowanie jonów metali wchodzących w skład centrum aktywnego enzymów. Na przykład cyjanki blokują atomy żelaza, EDTA (etylenodiaminotetraoctan) blokuje jony Ca, Mg.
3. Inhibitor allosteryczny oddziałuje z miejscem allosterycznym pośrednio przez nie na zasadzie kooperatywności, zmieniając strukturę i aktywność miejsca katalitycznego. Graficznie hamowanie niekonkurencyjne ma postać:
Maksymalnej szybkości reakcji w hamowaniu niekonkurencyjnym nie można osiągnąć poprzez zwiększenie stężenia substratu.
Regulacja aktywności enzymów podczas metabolizmu
Adaptacja organizmu do zmieniających się warunków (dieta, wpływ środowiska itp.) jest możliwa dzięki zmianie aktywności enzymów. Istnieje kilka możliwości regulacji szybkości reakcji enzymatycznych w organizmie:
1. Zmiana tempa syntezy enzymów (mechanizm ten wymaga długiego okresu czasu).
2. Zwiększenie dostępności substratu i enzymu poprzez zmianę przepuszczalności błon komórkowych.
3. Zmiana aktywności enzymów już obecnych w komórkach i tkankach. Mechanizm ten odbywa się z dużą prędkością i jest odwracalny.
W wieloetapowych procesach enzymatycznych izolowane są kluczowe enzymy regulacyjne, które ograniczają ogólną szybkość procesu. Najczęściej są to enzymy początkowego i końcowego etapu procesu. Zmiany aktywności kluczowych enzymów zachodzą poprzez różne mechanizmy.
1. Mechanizm allosteryczny:
2. Zmiana oligomeryzmu enzymu:
Monomery są nieaktywne - oligomery są aktywne
3. Fosfolilacja - defosforylacja:
Enzym (nieaktywny) + H 3 RO 4 - fosforylowany aktywny enzym.
Mechanizm autoregulacji jest szeroko rozpowszechniony w komórkach. Mechanizmem autoregulacyjnym jest w szczególności retroinhibicja, w której produkty procesu enzymatycznego hamują enzymy w początkowych stadiach. Na przykład wysokie stężenia nukleotydów purynowych i pirymidynowych hamują nukleotydy początkowe na etapie ich syntezy.
Czasami substraty początkowe aktywują enzymy końcowe, na schemacie: substrat A aktywuje F 3 . Na przykład aktywna forma glukozy (glukozo-6-fosforan) aktywuje końcowy enzym w syntezie glikogenu z glukozy (syntetaza glikogenu).
Strukturalna organizacja enzymów w komórce
Spójność procesów metabolicznych w organizmie jest możliwa dzięki strukturalnej dysocjacji enzymów w komórkach. Poszczególne enzymy znajdują się w określonych strukturach wewnątrzkomórkowych - podział . Na przykład enzym potasowy, ATPaza sodowa, jest aktywny w błonie plazmatycznej. W mitochondriach aktywne są enzymy reakcji oksydacyjnych (dehydrogenaza bursztynianowa, oksydaza cytochromowa). W jądrze aktywne są enzymy syntezy kwasów nukleinowych (polimeraza DNA). W lizosomach aktywne są enzymy rozkładające różne substancje (RNazy, fosfatazy i inne).
Enzymy najbardziej aktywne w danej strukturze komórkowej to tzw wskaźnik lub enzymy markerowe. Ich definicja w praktyce klinicznej odzwierciedla głębokość uszkodzenia tkanki strukturalnej. Niektóre enzymy łączą się w kompleksy polienzymatyczne, na przykład kompleks dehydrogenazy pirogronianowej (PDC), który utlenia kwas pirogronowy.
ZasadywykrycieIilościowydefinicjeenzymy:
Wykrywanie enzymów opiera się na ich wysokiej specyficzności. Enzymy są wykrywane na podstawie ich działania, tj. po zajściu reakcji katalizowanej przez enzym. Na przykład amylaza jest wykrywana przez rozkład skrobi do glukozy.
Kryteriami wystąpienia reakcji enzymatycznej mogą być:
zanik substratu reakcji
pojawienie się produktów reakcji
zmiana właściwości optycznych koenzymu.
Oznaczanie ilościowe enzymów
Ponieważ stężenie enzymów w komórkach jest bardzo niskie, nie określa się ich rzeczywistego stężenia, ale ilość enzymu ocenia się pośrednio, na podstawie aktywności enzymu.
Aktywność enzymatyczną ocenia się na podstawie szybkości reakcji enzymatycznej zachodzącej w optymalnych warunkach (optymalna temperatura, pH, zbyt wysokie stężenie substratu). W tych warunkach szybkość reakcji jest wprost proporcjonalna do stężenia enzymu (V=K3).
Jednostki działalność ( wielkie ilości ) enzym
W praktyce klinicznej stosuje się kilka jednostek aktywności enzymu.
1. Jednostka międzynarodowa - ilość enzymu, która katalizuje konwersję 1 mikromola substratu na minutę w temperaturze 25 0 C.
2. Katal (w układzie SI) - ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 mola substratu na sekundę.
3. Aktywność właściwa - stosunek aktywności enzymu do masy białka enzymu.
4. Aktywność molekularna enzymu pokazuje, ile cząsteczek substratu ulega przemianie pod wpływem działania 1 cząsteczki enzymu.
Fermentologia kliniczna
Wykorzystanie informacji o enzymach w praktyce lekarskiej jest działem enzymologii medycznej. Obejmuje 3 sekcje:
1. Enzymodiagnostyka
2. Enzymopotologia
3. Terapia enzymatyczna
Enzymodiagnostyka - sekcja badająca możliwości badania aktywności enzymów do diagnozowania chorób. Aby ocenić uszkodzenie poszczególnych tkanek, stosuje się specyficzne dla narządu enzymy, izoenzymy.
W praktyce pediatrycznej, przeprowadzając diagnostykę enzymatyczną, należy wziąć pod uwagę cechy dzieci. U dzieci aktywność niektórych enzymów jest wyższa niż u dorosłych, np. wysoka aktywność LDH odzwierciedla dominację procesów beztlenowych we wczesnym okresie poporodowym. Zawartość transaminaz w osoczu krwi dzieci wzrasta w wyniku zwiększonej przepuszczalności tkanki naczyniowej. Aktywność dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest zwiększona w wyniku wzmożonego rozpadu erytrocytów. Przeciwnie, aktywność innych enzymów jest niższa niż u dorosłych. Na przykład aktywność pepsyny, enzymów trzustkowych (lipazy, amylazy) jest zmniejszona z powodu niedojrzałości komórek wydzielniczych.
Wraz z wiekiem możliwa jest redystrybucja poszczególnych izoenzymów. Tak więc u dzieci przeważa LDH 3 (postać bardziej beztlenowa), au dorosłych LDH 2 (postać bardziej tlenowa).
Enzymopatologia - dział fermentologii zajmujący się badaniem chorób, których wiodącym mechanizmem rozwoju jest naruszenie aktywności enzymów. Należą do nich zaburzenia metaboliczne węglowodanów (galaktozemia, glikogenoza, mukopolisacharydozy), aminokwasów (fenyloketonuria, cystynuria), nukleotydów (orotaciduria), porfiryn (porfirii).
terapia enzymatyczna - dział fermentologii zajmujący się badaniem wykorzystania enzymów, koenzymów, aktywatorów, inhibitorów do celów terapeutycznych. Enzymy mogą być stosowane w celach substytucyjnych (pepsyna, enzymy trzustkowe), litycznych do usuwania mas martwiczych, skrzepów krwi, do rzadkich lepkich wysięków.
Literatura
1. Awdejewa, L.V. Biochemia: Podręcznik / LV Awdejewa, T.L. Aleinikova, LE Andrianowa; Pod redakcją E.S. Seweryn. - M.: GEOTAR-MED, 2013. - 768 s.
2. Auerman, T.L. Podstawy biochemii: Podręcznik / T.L. Auerman, TG Generalova, GM Suslanok. - M.: NITS INFRA-M, 2013. - 400 s.
3. Bazarnova Yu.G. Biochemiczne podstawy przetwarzania i przechowywania surowców pochodzenia zwierzęcego: Podręcznik / Yu.G. Bazarnova, T.E. Burowa, VI. Marczenko. - Sankt Petersburg: Ave. Nauka, 2011. - 192 s.
4. Baishev, I.M. Biochemia. Pytania testowe: Podręcznik / D.M. Zubairov, I.M. Baishev, R.F. Bajkejew; Pod redakcją D.M. Zubairowa. - M.: GEOTAR-Media, 2008. - 960 s.
5. Bokut, S.B. Biochemia filogenezy i ontogenezy: Podręcznik / A.A. Chirkin, EO Danchenko, S.B. Bukut; Pod sumą wyd.A. A. Czirkin. - M.: NITs INFRA-M, lis. wiedza, 2012. - 288 s.
6. Gidranowicz, VI. Biochemia: Podręcznik / VI. Gidranowicz, AV Gidranowicz. - Mińsk: TetraSystems, 2012. - 528 s.
7. Goloshchapov, A.P. Genetyczne i biochemiczne aspekty przystosowania człowieka do warunków miasta z rozwiniętym przemysłem chemicznym / A.P. Gołoszczapow. - M.: KMK, 2012. - 103 s.
8. Gunkova, PI Biochemia mleka i produktów mlecznych / K.K. Gorbatowa, PI Gunkow; Pod sumą wyd. K. K. Gorbatow. - Petersburg: GIORD, 2010. - 336 s.
9. Dimitriev, A.D. Biochemia: Podręcznik / A.D. Dimitriev, ED Ambrosiew. - M.: Daszkow i K, 2013. - 168 s.
10. Erszow, Yu.A. Biochemia ogólna i sport: Podręcznik / Yu.A. Erszow. - M.: MGU, 2010. - 368 s.
11. Erszow, Yu.A. Podstawy biochemii dla inżynierów: Podręcznik / Yu.A. Ershov, N.I. Zajcew; Pod redakcją S.I. Schukin. - M.: MSTU im. Bauman, 2010. - 359 s.
12. Kamysznikow, V.S. Podręcznik klinicznej i biochemicznej diagnostyki laboratoryjnej: W 2 tomach. W 2 tomach Podręcznik klinicznej i biochemicznej diagnostyki laboratoryjnej: W 2 tomach / V.S. Kamysznikow. - Mińsk: Białoruś, 2012. - 958 s.
13. Klopov, MI Substancje biologicznie czynne w procesach fizjologicznych i biochemicznych w organizmie zwierząt: Podręcznik / M.I. Klopov, V.I. Maksimow. - Petersburg: Lan, 2012. - 448 s.
14. Michajłow, S.S. Biochemia sportowa: Podręcznik dla uniwersytetów i szkół kultury fizycznej / S.S. Michajłow. - M.: Sow. sport, 2012. - 348 s.
15. Repnikow, B.T. Towaroznawstwo i biochemia produktów rybnych: Podręcznik / B.T. Repnikow. - M.: Daszkow i K, 2013. - 220 s.
16. Rogożyn, W.W. Biochemia mleka i mięsa: Podręcznik / V.V. Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2012. - 456 s.
17. Rogożyn, W.W. Biochemia roślin: podręcznik / V.V. Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2012. - 432 s.
18. Rogożyn, W.W. Warsztaty z fizjologii i biochemii roślin: Podręcznik / V.V. Rogożyn, TV Rogożyn. - Petersburg: GIORD, 2013. - 352 s.
19. Taganowicz, A.D. Biochemia patologiczna: Monografia / A.D. Taganowicz. - M.: BINOM, 2013. - 448 s.
20. Filippowicz, Yu.B. Biochemiczne podstawy życia człowieka: Podręcznik dla studentów / Yu.B. Filippowicz, A.S. Konichev, GA Sewastyanowa, N.M. Kutuzow. - M.: VLADOS, 2005. - 407 s.
21. Szczerbakow, W.G. Biochemia i towaroznawstwo surowców naftowych / V.G. Szczerbakow, V.G. Łobanow. - M.: KolosS, 2012. - 392 s.
Hostowane na Allbest.ru
...Podobne dokumenty
Klasyfikacja, mechanizm działania enzymów, ich zastosowanie w praktycznej działalności człowieka. Funkcjonowanie enzymów jamy ustnej, żołądka, jelita cienkiego. Określenie głównych przyczyn zaburzeń pracy narządów trawiennych u młodzieży.
praca semestralna, dodano 10.05.2014
Metody oznaczania aktywności, badanie parametrów kinetycznych reakcji enzymatycznych. Metody izolacji i oczyszczania enzymów. Badanie lokalizacji subkomórkowej. Zastosowanie enzymów jako odczynników analitycznych. Oznaczanie aktywności trypsyny.
samouczek, dodano 19.07.2009
Historia badań, funkcje i klasyfikacja enzymów: ich znaczenie medyczne i zastosowanie w reakcjach katalizowanych. Związek między enzymami a dziedzicznymi chorobami metabolicznymi. Rozwój metod leczenia, ich znaczenie w profilaktyce chorób.
prezentacja, dodano 16.04.2012
Historia odkrycia witamin; ich właściwości. Budowa chemiczna, mechanizm działania biologicznego i teoretyczna dzienna dawka witamin rozpuszczalnych w wodzie. Główne cechy grupy witamin rozpuszczalnych w tłuszczach. Chromatograficzne metody badań.
streszczenie, dodano 07.05.2014
Klasyfikacja i rodzaje retrowirusów jako nośników i aktywatorów onkogenów: silnie onkogenny, słabo onkogenny, mechanizm działania. Budowa, elementy i cykl rozwojowy tych wirusów. Ludzkie wirusy T-limfotropowe: epidemiologia, opis, profilaktyka.
praca semestralna, dodano 27.06.2011
Pojęcie i klasyfikacja enzymów (enzymów). Ich właściwości ogólne i odmienne od katalizatorów nieorganicznych, charakter białek. reakcje, które katalizują. Rodzaje izoenzymów i ich rola w metabolizmie. Względna aktywność enzymów w tkankach ludzkich.
prezentacja, dodano 11.11.2016
Koncepcje indukcji enzymów podrodziny CYP 3A przez ksenobiotyki i inne związki chemiczne. Cechy ontogenezy w tym procesie. Aspekty genetyczne wpływające na aktywność enzymów z podrodziny CYP 3A. Rodziny receptorów jądrowych.
praca naukowa, dodano 05.12.2009
Badanie leków pod ogólną nazwą „antybiotyki”. Antybakteryjne środki chemioterapeutyczne. Historia odkrycia antybiotyków, ich mechanizm działania i klasyfikacja. Cechy stosowania antybiotyków i ich skutki uboczne.
praca semestralna, dodano 16.10.2014
Grupa penicylin to rozwój oparty na produktach odpadowych mikroorganizmów. Podział penicylin na naturalne i syntetyczne. Mechanizm działania: działanie bakteriobójcze i rola enzymów. Charakterystyka spektrum działania, farmakokinetyka.
streszczenie, dodano 24.01.2012
Molekularne i biochemiczne podstawy terapeutycznego działania preparatów peptydowych. Mechanizm działania neuroprotektorów. Molekularny mechanizm działania actovegin, nimodypiny. Enzymatyczne i nieenzymatyczne przeciwutleniacze. Ogólne zasady działania nootropów.
RozdziałIV.3.
Enzymy
Metabolizm w organizmie można określić jako całość wszystkich przemian chemicznych, którym ulegają związki pochodzące z zewnątrz. Przemiany te obejmują wszystkie znane typy reakcji chemicznych: międzycząsteczkowe przenoszenie grup funkcyjnych, hydrolityczne i niehydrolityczne rozszczepianie wiązań chemicznych, przegrupowania wewnątrzcząsteczkowe, tworzenie nowych wiązań chemicznych i reakcje redoks. Takie reakcje zachodzą w organizmie z niezwykle dużą szybkością tylko w obecności katalizatorów. Wszystkie katalizatory biologiczne są substancjami o charakterze białkowym i nazywane są enzymami (dalej F) lub enzymami (E).
Enzymy nie są składnikami reakcji, a jedynie przyspieszają osiągnięcie równowagi poprzez zwiększenie szybkości przemian zarówno bezpośrednich, jak i odwrotnych. Przyspieszenie reakcji następuje na skutek spadku energii aktywacji - bariery energetycznej oddzielającej jeden stan układu (początkowy związek chemiczny) od drugiego (produkt reakcji).
Enzymy przyspieszają wiele różnych reakcji w organizmie. A więc dość prosta z punktu widzenia chemii tradycyjnej reakcja odszczepienia wody z kwasu węglowego z wytworzeniem CO 2 wymaga udziału enzymu, ponieważ bez niego postępuje zbyt wolno, aby regulować pH krwi. Dzięki katalitycznemu działaniu enzymów w organizmie możliwe staje się przeprowadzenie takich reakcji, które bez katalizatora przebiegałyby setki i tysiące razy wolniej.
Właściwości enzymów
1. Wpływ na szybkość reakcji chemicznej: enzymy zwiększają szybkość reakcji chemicznej, ale same nie są zużywane.
Szybkość reakcji to zmiana stężenia składników reakcji w jednostce czasu. Jeśli idzie w kierunku do przodu, to jest proporcjonalny do stężenia reagentów; jeśli idzie w kierunku przeciwnym, to jest proporcjonalny do stężenia produktów reakcji. Stosunek szybkości reakcji do przodu i do tyłu nazywa się stałą równowagi. Enzymy nie mogą zmieniać wartości stałej równowagi, ale stan równowagi w obecności enzymów następuje szybciej.
2. Specyfika działania enzymów. W komórkach organizmu zachodzi 2-3 tysiące reakcji, z których każda jest katalizowana przez określony enzym. Specyfika działania enzymu polega na zdolności do przyspieszenia przebiegu jednej określonej reakcji bez wpływu na szybkość innych, nawet bardzo podobnych.
Wyróżnić:
Absolutny– gdy F katalizuje tylko jedną określoną reakcję ( arginaza- rozpad argininy
Względny(grupa specjalna) - F katalizuje określoną klasę reakcji (np. rozszczepienie hydrolityczne) lub reakcje z udziałem określonej klasy substancji.
Specyficzność enzymów wynika z ich unikalnej sekwencji aminokwasowej, która determinuje konformację centrum aktywnego, które oddziałuje ze składnikami reakcji.
Nazywa się substancję, której przemiana chemiczna jest katalizowana przez enzym podłoże ( S ) .
3. Aktywność enzymów to zdolność do przyspieszania szybkości reakcji w różnym stopniu. Aktywność wyraża się w:
1) Międzynarodowe jednostki aktywności - (IU) ilość enzymu katalizującego przemianę 1 μM substratu w ciągu 1 min.
2) Katalakh (cat) - ilość katalizatora (enzymu) zdolna do przekształcenia 1 mola substratu w ciągu 1 s.
3) Aktywność właściwa - liczba jednostek aktywności (dowolnej z powyższych) w badanej próbce do całkowitej masy białka w tej próbce.
4) Rzadziej stosuje się aktywność molową - liczbę cząsteczek substratu przekształconych przez jedną cząsteczkę enzymu na minutę.
aktywność zależy od temperatura . Ten lub inny enzym wykazuje największą aktywność w optymalnej temperaturze. Dla F żywego organizmu wartość ta mieści się w przedziale +37,0 - +39,0° C, w zależności od rodzaju zwierzęcia. Wraz ze spadkiem temperatury ruchy Browna spowalniają, szybkość dyfuzji maleje, aw konsekwencji spowalnia proces tworzenia kompleksu między enzymem a składnikami reakcji (substratami). W przypadku wzrostu temperatury powyżej +40 - +50° Wraz z cząsteczką enzymu, jaką jest białko, ulega procesowi denaturacji. Jednocześnie zauważalnie spada szybkość reakcji chemicznej (rys. 4.3.1.).
Aktywność enzymów zależy również od średnie pH . Dla większości z nich istnieje pewna optymalna wartość pH, przy której ich aktywność jest maksymalna. Ponieważ komórka zawiera setki enzymów, a każdy z nich ma swoje własne optymalne granice pH, zmiana pH jest jednym z ważnych czynników w regulacji aktywności enzymatycznej. Tak więc w wyniku jednej reakcji chemicznej z udziałem pewnego enzymu, którego pH opt mieści się w przedziale 7,0 - 7,2, powstaje produkt, którym jest kwas. W tym przypadku wartość pH przesuwa się do zakresu 5,5 - 6,0. Aktywność enzymu gwałtownie spada, szybkość tworzenia produktu zwalnia, ale aktywowany jest inny enzym, dla którego te wartości pH są optymalne, a produkt pierwszej reakcji ulega dalszej przemianie chemicznej. (Kolejny przykład dotyczący pepsyny i trypsyny).
Chemiczna natura enzymów. Struktura enzymu. Centra aktywne i allosteryczne
Wszystkie enzymy są białkami o masie cząsteczkowej od 15 000 do kilku milionów Da. Zgodnie ze strukturą chemiczną są prosty enzymy (składają się tylko z AA) i złożony enzymy (mają część niebiałkową lub grupę prostetyczną). Część białkowa nazywa się apoenzym, i niebiałkowe, jeśli jest kowalencyjnie połączone z apoenzymem, to się nazywa koenzym, a jeśli wiązanie jest niekowalencyjne (jonowe, wodorowe) - kofaktor . Funkcje grupy prostetycznej to: udział w akcie katalizy, kontakt enzymu z substratem, stabilizacja cząsteczki enzymu w przestrzeni.
Substancje nieorganiczne zwykle działają jako kofaktor - jony cynku, miedzi, potasu, magnezu, wapnia, żelaza, molibdenu.
Koenzymy można uznać za integralną część cząsteczki enzymu. Są to substancje organiczne, wśród których są: nukleotydy ( ATP, UMF itp.), witamin lub ich pochodnych ( TDF- z tiaminy ( W 1), FMN- z ryboflawiny ( O 2), koenzym A- z kwasu pantotenowego ( O 3), NAD itp.) oraz koenzymy tetrapirolowe - hemy.
W procesie katalizy reakcji z substratem styka się nie cała cząsteczka enzymu, ale pewna jej część, tzw. aktywne centrum. Ta strefa cząsteczki nie składa się z sekwencji aminokwasów, ale powstaje, gdy cząsteczka białka jest skręcona w strukturę trzeciorzędową. Oddzielne sekcje aminokwasów zbliżają się do siebie, tworząc pewną konfigurację centrum aktywnego. Ważną cechą strukturalną centrum aktywnego jest to, że jego powierzchnia jest komplementarna z powierzchnią podłoża; Reszty AA tej strefy enzymu mogą wchodzić w reakcje chemiczne z określonymi grupami substratu. Można to sobie wyobrazić miejsce aktywne enzymu pasuje do struktury substratu jak klucz i zamek.
W aktywne centrum wyróżnia się dwie strefy: ośrodek wiążący, odpowiedzialny za mocowanie podłoża, oraz ośrodek katalityczny odpowiedzialny za przemianę chemiczną podłoża. W skład centrum katalitycznego większości enzymów wchodzą takie AA jak Ser, Cys, His, Tyr, Lys. Złożone enzymy w centrum katalitycznym mają kofaktor lub koenzym.
Oprócz centrum aktywnego wiele enzymów jest wyposażonych w centrum regulacyjne (allosteryczne). Substancje wpływające na jego aktywność katalityczną oddziałują z tą strefą enzymu.
Mechanizm działania enzymów
Akt katalizy składa się z trzech następujących po sobie etapów.
1. Tworzenie kompleksu enzym-substrat podczas interakcji przez centrum aktywne.
2. Wiązanie substratu zachodzi w kilku punktach centrum aktywnego, co prowadzi do zmiany struktury substratu, jego deformacji w wyniku zmiany energii wiązania w cząsteczce. Jest to drugi etap i nazywa się aktywacją substratu. Kiedy to następuje, następuje pewna modyfikacja chemiczna podłoża i jego przekształcenie w nowy produkt lub produkty.
3. W wyniku takiego przekształcenia nowa substancja (produkt) traci zdolność zatrzymywania się w centrum aktywnym enzymu, a enzym-substrat, a właściwie kompleks enzym-produkt, dysocjuje (rozpada się).
Rodzaje reakcji katalitycznych:
A + E \u003d AE \u003d BE \u003d E + B
A + B + E \u003d AE + B \u003d ABE \u003d AB + E
AB + E \u003d ABE \u003d A + B + E, gdzie E to enzym, A i B to substraty lub produkty reakcji.
Efektory enzymatyczne - substancje, które zmieniają szybkość katalizy enzymatycznej, a tym samym regulują metabolizm. Wśród nich wyróżnia się inhibitory - spowolnienie tempa reakcji i aktywatory - przyspieszenie reakcji enzymatycznej.
W zależności od mechanizmu hamowania reakcji wyróżnia się inhibitory kompetycyjne i niekompetycyjne. Struktura cząsteczki inhibitora kompetycyjnego jest podobna do struktury substratu i pokrywa się z powierzchnią centrum aktywnego jak klucz z zamkiem (lub prawie pokrywa się). Stopień tego podobieństwa może być nawet wyższy niż z podłożem.
Jeśli A + E \u003d AE \u003d BE \u003d E + B, to I + E \u003d IE¹
Stężenie enzymu zdolnego do katalizy spada, a szybkość powstawania produktów reakcji gwałtownie spada (ryc. 4.3.2.).
Duża liczba substancji chemicznych pochodzenia endogennego i egzogennego (tj. powstających w organizmie i pochodzących z zewnątrz - odpowiednio ksenobiotyki) działa jako konkurencyjne inhibitory. Substancje endogenne są regulatorami metabolizmu i nazywane są antymetabolitami. Być może wiele z nich jest stosowanych w leczeniu chorób onkologicznych i mikrobiologicznych. hamują kluczowe reakcje metaboliczne mikroorganizmów (sulfonamidy) i komórek nowotworowych. Ale przy nadmiarze substratu i niskim stężeniu konkurencyjnego inhibitora jego działanie jest anulowane.
Drugi rodzaj inhibitorów jest niekompetycyjny. Oddziałują z enzymem poza miejscem aktywnym, a nadmiar substratu nie wpływa na ich zdolność hamowania, jak ma to miejsce w przypadku inhibitorów kompetycyjnych. Inhibitory te oddziałują albo z pewnymi grupami enzymu (metale ciężkie wiążą się z grupami tiolowymi Cys), albo najczęściej z centrum regulatorowym, co zmniejsza zdolność wiązania centrum aktywnego. Właściwy proces hamowania polega na całkowitym lub częściowym stłumieniu aktywności enzymu przy zachowaniu jego pierwotnej i przestrzennej struktury.
Istnieje również odwracalne i nieodwracalne hamowanie. Nieodwracalne inhibitory dezaktywują enzym, tworząc wiązanie chemiczne z jego AA lub innymi składnikami strukturalnymi. Zwykle jest to wiązanie kowalencyjne z jednym z miejsc centrum aktywnego. Taki kompleks praktycznie nie dysocjuje w warunkach fizjologicznych. W innym przypadku inhibitor zaburza strukturę konformacyjną cząsteczki enzymu – powodując jej denaturację.
Działanie odwracalnych inhibitorów można zniwelować nadmiarem substratu lub działaniem substancji zmieniających strukturę chemiczną inhibitora. Kompetycyjne i niekonkurencyjne inhibitory są w większości przypadków odwracalne.
Oprócz inhibitorów znane są również aktywatory katalizy enzymatycznej. Oni:
1) chronić cząsteczkę enzymu przed działaniem inaktywującym,
2) tworzą kompleks z substratem, który bardziej aktywnie wiąże się z centrum aktywnym F,
3) oddziałując z enzymem o strukturze czwartorzędowej, rozdzielają jego podjednostki i tym samym otwierają dostęp substratu do centrum aktywnego.
Dystrybucja enzymów w organizmie
Enzymy biorące udział w syntezie białek, kwasów nukleinowych i enzymów metabolizmu energetycznego są obecne we wszystkich komórkach organizmu. Ale komórki pełniące specjalne funkcje zawierają również specjalne enzymy. Tak więc komórki wysepek Langerhansa w trzustce zawierają enzymy, które katalizują syntezę hormonów insuliny i glukagonu. Enzymy charakterystyczne tylko dla komórek niektórych narządów nazywane są specyficznymi dla narządu: arginaza i urokinaza- wątroba, kwaśna fosfataza- prostata. Zmieniając stężenie takich enzymów we krwi, ocenia się obecność patologii w tych narządach.
W komórce poszczególne enzymy są rozmieszczone w cytoplazmie, inne są osadzone w błonach mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego, takie enzymy tworzą przegródki, w którym zachodzą pewne, ściśle ze sobą powiązane etapy metabolizmu.
Wiele enzymów powstaje w komórkach i jest wydzielanych do jam anatomicznych w stanie nieaktywnym - są to proenzymy. Często w postaci proenzymów powstają enzymy proteolityczne (rozkładające białka). Następnie pod wpływem pH lub innych enzymów i substratów następuje ich modyfikacja chemiczna i centrum aktywne staje się dostępne dla substratów.
Istnieje również izoenzymy - enzymy, które różnią się budową molekularną, ale pełnią tę samą funkcję.
Nomenklatura i klasyfikacja enzymów
Nazwa enzymu jest utworzona z następujących części:
1. nazwa podłoża, z którym oddziałuje
2. charakter katalizowanej reakcji
3. nazwa klasy enzymu (ale jest to opcjonalne)
4. sufiks -aza-
pirogronian - dekarboksyl - aza, bursztynian - dewodór - aza
Ponieważ znanych jest już około 3 tysięcy enzymów, należy je sklasyfikować. Obecnie przyjęto międzynarodową klasyfikację enzymów, która opiera się na rodzaju katalizowanej reakcji. Istnieje 6 klas, które z kolei dzielą się na szereg podklas (w tej książce są one przedstawione tylko wybiórczo):
1. oksydoreduktazy. Katalizuj reakcje redoks. Są one podzielone na 17 podklas. Wszystkie enzymy zawierają część niebiałkową w postaci hemu lub pochodnych witamin B 2, B 5. Podlegający utlenianiu substrat działa jako donor wodoru.
1.1. Dehydrogenazy usuwają wodór z jednego substratu i przenoszą go na inne substraty. Koenzymy NAD, NADP, FAD, FMN. Przyjmują odcięty przez enzym wodór, zamieniając się w formę zredukowaną (NADH, NADPH, FADH) i przenoszą go do innego kompleksu enzym-substrat, gdzie jest oddawany.
1.2. Oksydaza - katalizuje przeniesienie wodoru do tlenu z utworzeniem wody lub H 2 O 2. F. Cytochromoksydazałańcuch oddechowy.
RH + NAD H + O 2 = ROH + NAD + H 2 O
1.3. Monooksydazy - cytochrom P450. Zgodnie ze swoją strukturą, zarówno hemo-, jak i flawoproteina. Hydroksyluje lipofilowe ksenobiotyki (według mechanizmu opisanego powyżej).
1.4. peroksydazyI katalaza- katalizują rozkład nadtlenku wodoru, który powstaje podczas reakcji metabolicznych.
1.5. Oksygenazy - katalizują reakcje dodawania tlenu do podłoża.
2. Transferazy - katalizują przeniesienie różnych rodników z cząsteczki donorowej na cząsteczkę akceptorową.
A A+ mi + b = mi A+ ZA + B = E + B A+ A
2.1. metylotransferaza (CH3-).
2.2 Karboksylo- i karbamoilotransferazy.
2.2. Acylotransferazy - Koenzym A (przeniesienie grupy acylowej - RC=O).
Przykład: synteza neuroprzekaźnika acetylocholiny (patrz rozdział „Metabolizm białek”).
2.3. Transferazy heksozylowe katalizują przenoszenie reszt glikozylowych.
Przykład: rozszczepienie cząsteczki glukozy z glikogenu pod działaniem fosforylaza.
2.4. Aminotransferazy - przenoszenie grup aminowych
R 1- CO - R 2 + R 1 - CH - NH 3 - R 2 \u003d R 1 - CH - NH 3 - R2 + R1 - CO - R2
Odgrywają ważną rolę w przemianie AK. Powszechnym koenzymem jest fosforan pirydoksalu.
Przykład: aminotransferaza alaninowa(AlAT): pirogronian + glutaminian = alanina + alfa-ketoglutaran (patrz rozdział „Metabolizm białek”).
2.5. Fosfotransfereza (kinaza) - katalizuje przeniesienie reszty kwasu fosforowego. W większości przypadków donorem fosforanów jest ATP. Enzymy tej klasy biorą udział głównie w procesie rozkładu glukozy.
Przykład: Kinaza hekso (gluko)..
3. Hydrolazy - katalizują reakcje hydrolizy, tj. rozszczepienie substancji z dodatkiem w miejscu zerwania wiązania wody. Ta klasa obejmuje głównie enzymy trawienne, są one jednoskładnikowe (nie zawierają części niebiałkowej)
R1-R2 + H2O \u003d R1H + R2OH
3.1.
Esterazy - rozkładają niezbędne wiązania. Jest to duża podklasa enzymów, które katalizują hydrolizę estrów tiolowych, fosfoestrów.
Przykład: NH2).
Przykład: arginaza(cykl mocznikowy).
4. Liasy - katalizują reakcje rozszczepienia cząsteczek bez dodatku wody. Enzymy te mają część niebiałkową w postaci pirofosforanu tiaminy (B 1) i fosforanu pirydoksalu (B 6).
4.1. Liazy wiązań C-C. Są one powszechnie określane jako dekarboksylazy.
Przykład: dekarboksylaza pirogronianowa.
5.Izomerazy - katalizują reakcje izomeryzacji.
Przykład: izomeraza fosfopentozy, izomeraza pentozofosforanowa(enzymy nieutleniającej gałęzi szlaku pentozofosforanowego).
6. Ligazy katalizują syntezę bardziej złożonych substancji z prostych. Takie reakcje przebiegają z wydatkowaniem energii ATP. Do nazwy takich enzymów dodaje się syntetazę.
LITERATURA DO ROZDZIAŁU IV.3.
1. Byshevsky A. Sh., Tersenov O. A. Biochemia dla lekarza // Ekaterinburg: Ural worker, 1994, 384 s.;
2. Knorre D.G., Myzina SD. Chemia biologiczna. - M.: Wyżej. szkoła 1998, 479 s.;
3. Filippovich Yu. B., Egorova T. A., Sevastyanova G. A. Warsztaty z biochemii ogólnej // M.: Prosveschenie, 1982, 311 s.;
4. Lehninger A. Biochemia. Molekularne podstawy budowy i funkcji komórki // M.: Mir, 1974, 956 s.;
5. Pustovalova L.M. Warsztaty z biochemii // Rostów nad Donem: Phoenix, 1999, 540 s.
Mechanizm działania enzymów
Mechanizm działania enzymów można rozpatrywać z dwóch punktów widzenia: z punktu widzenia zmian energii reakcji chemicznych oraz z punktu widzenia zdarzeń w centrum aktywnym.
A. Przemiany energii w reakcjach chemicznych
Wszelkie reakcje chemiczne przebiegają zgodnie z dwoma podstawowymi prawami termodynamiki: prawem zachowania energii i prawem entropii. Zgodnie z tymi prawami całkowita energia układu chemicznego i jego otoczenia pozostaje stała, podczas gdy układ chemiczny ma tendencję do zmniejszania porządku (zwiększania entropii). Aby zrozumieć energię reakcji chemicznej, nie wystarczy znać bilans energetyczny reagentów wchodzących i wychodzących z reakcji, konieczne jest uwzględnienie zmian energii w przebiegu danej reakcji chemicznej oraz roli enzymów w dynamice tego procesu. Rozważ reakcję rozkładu kwasu węglowego:
H2CO3 > H20 + C02.
Kwas węglowy jest słaby; reakcja jego rozkładu będzie przebiegać w normalnych warunkach, jeśli cząsteczki kwasu węglowego mają energię przekraczającą pewien poziom, zwany energią aktywacji E a (ryc. 2-10).
Energia aktywacji to dodatkowa energia kinetyczna potrzebna cząsteczkom substancji do reakcji.
Po osiągnięciu tej bariery energetycznej w cząsteczce zachodzą zmiany, które powodują redystrybucję wiązań chemicznych i powstawanie nowych związków. O cząsteczkach z E a mówi się, że znajdują się w stanie przejściowym. Różnica energii między początkowym odczynnikiem H 2 CO 3 a końcowymi związkami H 2 O i CO 2 nazywana jest zmianą swobodnego
Ryż. 2-10. Zmiana energii swobodnej podczas rozkładu kwasu węglowego.
Energie reakcji DG. Cząsteczki H 2 O i CO 2 są bardziej stabilnymi substancjami niż H 2 CO 3 , tj. mają mniej energii i praktycznie nie reagują w normalnych warunkach. Uwolniona w wyniku tej reakcji energia jest rozpraszana w postaci ciepła do otoczenia.
Im więcej cząsteczek ma energię przekraczającą poziom E a, tym większa jest szybkość reakcji chemicznej. Szybkość reakcji chemicznej można zwiększyć przez ogrzewanie. Zwiększa to energię reagujących cząsteczek. Jednak wysokie temperatury są szkodliwe dla żywych organizmów, dlatego w komórce stosuje się enzymy, które przyspieszają reakcje chemiczne. Enzymy zapewniają wysoką szybkość reakcji w optymalnych warunkach panujących w komórce, poprzez obniżenie poziomu Ea. W ten sposób enzymy obniżają wysokość bariery energetycznej, w wyniku czego zwiększa się liczba cząsteczek reaktywnych, a zatem zwiększa się szybkość reakcji.
W mechanizmie katalizy enzymatycznej decydujące znaczenie ma powstawanie nietrwałych półproduktów - kompleksu enzym-substrat ES, który ulega przemianie w niestabilny kompleks przejściowy EP, który niemal natychmiast rozkłada się na wolny enzym i produkt reakcji.
Zatem katalizatory biologiczne (enzymy) nie zmieniają energii swobodnej
substratów i produktów, a zatem nie zmieniają równowagi reakcji (ryc. 2-11).
Enzym, działając jako katalizator reakcji chemicznej, podlega ogólnym prawom katalizy i posiada wszystkie właściwości charakterystyczne dla katalizatorów niebiologicznych, jednak posiada również charakterystyczne właściwości związane z cechami strukturalnymi enzymów.
Enzymy są podobne do katalizatorów niebiologicznych w tym, że:
- Enzymy katalizują reakcje możliwe energetycznie;
- energia układu chemicznego pozostaje stała;
- podczas katalizy kierunek reakcji nie zmienia się;
- Enzymy nie są zużywane podczas reakcji.
Różnice między enzymami a katalizatorami niebiologicznymi polegają na tym, że:
- · szybkość reakcji enzymatycznych jest większa niż reakcji katalizowanych katalizatorami niebiałkowymi;
- Enzymy mają wysoką specyficzność;
- W komórce zachodzi reakcja enzymatyczna, tj. w temperaturze 37°C, przy stałym ciśnieniu atmosferycznym i fizjologicznym pH;
- Szybkość reakcji enzymatycznej można regulować.
1. Tworzenie kompleksu enzym-substrat
Fakt, że enzymy mają wysoką specyficzność, umożliwił w 1890 r. postawienie hipotezy, zgodnie z którą centrum aktywne enzymu jest komplementarne do substratu, tj. odpowiada mu jako „klucz do zamka”. Po interakcji substratu („klucza”) z centrum aktywnym („zamek”) zachodzą przemiany chemiczne substratu w produkt. Centrum aktywne uznano za stabilną, sztywno określoną strukturę.
W 1959 roku zaproponowano inny wariant hipotezy „zamka na klucz”, aby wyjaśnić zdarzenia w miejscu aktywnym enzymu. Zgodnie z tą hipotezą ośrodek aktywny jest strukturą elastyczną
Ryż. 2-11. Zmiana energii swobodnej podczas reakcji chemicznej niekatalizowanej i katalizowanej przez enzymy.
Enzym obniża energię aktywacji E a, tj. zmniejsza wysokość bariery energetycznej, w wyniku czego zwiększa się udział cząsteczek reaktywnych, a zatem zwiększa się szybkość reakcji w stosunku do podłoża. Substrat, oddziałując z centrum aktywnym enzymu, powoduje zmianę jego konformacji, prowadząc do powstania korzystnego dla chemicznych modyfikacji substratu kompleksu enzym-substrat. W tym przypadku cząsteczka substratu zmienia również swoją konformację, co zapewnia wyższą wydajność reakcji enzymatycznej. Ta „hipoteza indukowanego dopasowania” została następnie potwierdzona eksperymentalnie.
2. Sekwencja zdarzeń podczas katalizy enzymatycznej
Proces katalizy enzymatycznej można warunkowo podzielić na następujące etapy (ryc. 2-12). reakcja chemiczna katalizy substratowej
Pierwszy, drugi i czwarty etap katalizy są krótkie i zależą od stężenia substratu (dla pierwszego etapu) oraz stałych wiązania ligandu w miejscu aktywnym enzymu (dla pierwszego i trzeciego etapu). Zmiany energii reakcji chemicznej na tych etapach są nieznaczne.
Trzeci etap jest najwolniejszy; jego czas trwania zależy od energii aktywacji reakcji chemicznej. Na tym etapie wiązania są rozrywane w cząsteczce substratu, powstają nowe wiązania i powstaje cząsteczka produktu.
3. Rola miejsca aktywnego w katalizie enzymatycznej
W wyniku badań wykazano, że cząsteczka enzymu z reguły jest wielokrotnie większa niż cząsteczka substratu ulegająca przemianie chemicznej przez ten enzym. Tylko niewielka część cząsteczki enzymu wchodzi w kontakt z substratem, zwykle od 5 do 10 reszt aminokwasowych, które tworzą miejsce aktywne enzymu. Rolą pozostałych reszt aminokwasowych jest zapewnienie prawidłowej konformacji cząsteczki enzymu dla optymalnego przebiegu reakcji chemicznej.
Miejsce aktywne na wszystkich etapach katalizy enzymatycznej nie może być uważane za pasywne miejsce wiązania substratu. Jest to złożona „maszyna” molekularna, która wykorzystuje różnorodne mechanizmy chemiczne do promowania przekształcenia substratu w produkt.
W centrum aktywnym enzymu substraty są ułożone w taki sposób, że grupy funkcyjne substratów biorących udział w reakcji znajdują się blisko siebie. Ta właściwość centrum aktywnego nazywana jest efektem zbliżania się i orientacji reagentów. Tak uporządkowany układ substratów powoduje spadek entropii, aw konsekwencji spadek energii aktywacji (E a), która decyduje o wydajności katalitycznej enzymów.
Centrum aktywne enzymu przyczynia się również do destabilizacji wiązań międzyatomowych w cząsteczce substratu, co ułatwia przebieg reakcji chemicznej i powstawanie produktów. Ta właściwość miejsca aktywnego nazywana jest efektem deformacji podłoża (ryc. 2-12).
Ryż. 2-12. Etapy katalizy enzymatycznej.
I - etap zbliżania i orientacji substratu względem centrum aktywnego enzymu; II - tworzenie kompleksu enzym-substrat (ES) w wyniku indukowanej podatności; III - deformacja substratu i tworzenie niestabilnego kompleksu enzym-produkt (EP); IV- rozpad kompleksu (EP) z uwolnieniem produktów reakcji z centrum aktywnego enzymu i uwolnieniem enzymu.
B. Molekularne mechanizmy katalizy enzymatycznej
O mechanizmach katalizy enzymatycznej decyduje rola grup funkcyjnych centrum aktywnego enzymu w reakcji chemicznej przemiany substratu w produkt. Istnieją 2 główne mechanizmy katalizy enzymatycznej: kataliza kwasowo-zasadowa i kataliza kowalencyjna.
1. Kataliza kwasowo-zasadowa
Pojęcie katalizy kwasowo-zasadowej wyjaśnia aktywność enzymatyczną udziałem grup kwasowych (donorów protonów) i/lub grup zasadowych (akceptorów protonów) w reakcji chemicznej. Kataliza kwasowo-zasadowa jest powszechnym zjawiskiem. Reszty aminokwasowe tworzące centrum aktywne mają grupy funkcyjne, które wykazują właściwości zarówno kwasów, jak i zasad.
Aminokwasy biorące udział w katalizie kwasowo-zasadowej obejmują przede wszystkim Cys, Tyr, Ser, Lys, Glu, Asp i His. Rodniki tych aminokwasów w formie protonowanej są kwasami (donorami protonów), w formie deprotonowanej są to zasady (akceptory protonów). Dzięki tej właściwości grup funkcyjnych miejsca aktywnego enzymy stają się unikalnymi katalizatorami biologicznymi, w przeciwieństwie do katalizatorów niebiologicznych, które mogą wykazywać właściwości kwasowe lub zasadowe.
Przykładem katalizy kwasowo-zasadowej, w której kofaktorami są jony Zn 2+, a koenzymem jest cząsteczka NAD+, jest enzym wątrobowej dehydrogenazy alkoholowej, który katalizuje reakcję utleniania alkoholu (ryc. 2-13):
C2H5OH + NAD + > CH3-SON + NADH + H
2. Kataliza kowalencyjna
Kataliza kowalencyjna polega na ataku grup nukleofilowych (ujemnie naładowanych) lub elektrofilowych (dodatnio naładowanych) centrum aktywnego enzymu przez cząsteczki substratu z utworzeniem wiązania kowalencyjnego między substratem a koenzymem lub grupą funkcyjną amino reszta kwasowa (zwykle jedna) centrum aktywnego enzymu.
Działanie proteaz serynowych, takich jak trypsyna, chymotrypsyna i trombina, jest przykładem mechanizmu katalizy kowalencyjnej, gdy między substratem a resztą aminokwasową serynową miejsca aktywnego enzymu tworzy się wiązanie kowalencyjne. Określenie „proteazy serynowe” wynika z faktu, że reszta aminokwasowa seryny jest częścią centrum aktywnego wszystkich tych enzymów i bierze bezpośredni udział w katalizie. Rozważmy mechanizm katalizy kowalencyjnej na przykładzie chymotrypsyny, która hydrolizuje wiązania peptydowe podczas trawienia białek w dwunastnicy (patrz rozdział 9). Substratami chymotrypsyny są peptydy zawierające aminokwasy aromatyczne i cykliczne
Ryż. 2-13. Mechanizm katalizy kwasowo-zasadowej na przykładzie wątrobowej dehydrogenazy alkoholowej.
I - cząsteczka etanolu ma centrum wiążące, które zapewnia oddziaływanie hydrofobowe między centrum aktywnym a grupą metylową alkoholu; II - dodatnio naładowany atom cynku przyczynia się do eliminacji protonu z grupy alkoholowej etanolu z utworzeniem ujemnie naładowanego atomu tlenu. Ujemny ładunek jest redystrybuowany między atomem tlenu i sąsiednim atomem wodoru, który jest następnie przenoszony w postaci hydrationu na czwarty atom węgla koenzymu nikotynamidu NAD+; III - w efekcie powstają zredukowane formy NADH i aldehyd octowy.
Rodniki hydrofobowe (Phen, Tyr, Tri), co wskazuje na udział sił hydrofobowych w tworzeniu kompleksu enzym-substrat. Mechanizm katalizy kowalencyjnej chymotrypsyny przedstawiono na ryc. 2-14.
Rodniki Asp 102, Gis 57 i Ser 195 biorą bezpośredni udział w akcie katalizy. Na skutek nukleofilowego ataku wiązania peptydowego substratu, wiązanie to zostaje zerwane z wytworzeniem kowalencyjnie zmodyfikowanej seryny - acylo-chymotrypsyny. Kolejny fragment peptydu jest uwalniany w wyniku zerwania wiązania wodorowego między fragmentem peptydu a His57 miejsca aktywnego chymotrypsyny. Ostatnim etapem hydrolizy wiązania peptydowego białek jest deacylacja chymotrypsyny w obecności cząsteczki wody z uwolnieniem drugiego fragmentu hydrolizowalnego białka i początkowej formy enzymu.
enzym kataliza biologiczna transaminacja
Odkrycie struktury przestrzennej wielu enzymów za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej dostarczyło wiarygodnych podstaw do skonstruowania racjonalnych schematów mechanizmu ich działania.
Ustalenie mechanizmu działania enzymów ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia zależności strukturalnych i funkcjonalnych w różnych układach biologicznie czynnych.
Lizozym występuje w różnych tkankach zwierząt i roślin, w szczególności w płynie łzowym i białku jaja. Lizozym działa jako środek przeciwbakteryjny poprzez katalizowanie hydrolizy ścian komórkowych wielu bakterii. Ten polisacharyd jest utworzony przez naprzemienne reszty kwasu N-acetylomuranowego (NAM) połączone wiązaniem 1,4-glikozydowym (łańcuchy polisacharydowe są usieciowane krótkimi fragmentami peptydowymi).
Polisacharyd bakteryjny jest bardzo złożonym związkiem nierozpuszczalnym, dlatego jako substraty lizozymu często stosuje się dobrze hydrolizujące oligosacharydy utworzone przez reszty NAG.
Lizozym białka jaja kurzego składa się z pojedynczego łańcucha polipeptydowego zawierającego 129 reszt aminokwasowych; jego masa cząsteczkowa wynosi 14 600. Wysoką stabilność enzymu zapewnia obecność czterech mostków dwusiarczkowych.
Informacje o centrum aktywnym i rodzaju procesu katalitycznego uzyskał D. Philips w 1965 roku. na podstawie badań dyfrakcji rentgenowskiej lizozymu i jego kompleksów z inhibitorami. Cząsteczka lizozymu ma kształt elipsoidy o osiach 4,5*3*3 nm; pomiędzy dwiema połówkami cząsteczki znajduje się „luka”, w której zachodzi wiązanie oligosacharydów. Ściany szczeliny tworzą głównie łańcuchy boczne aminokwasów niepolarnych, które zapewniają wiązanie niepolarnych cząsteczek substratu, a także zawierają łańcuchy boczne aminokwasów polarnych, które są zdolne do tworzenia wiązań wodorowych z grupami acyloaminowymi i hydroksylowymi substratu. Wielkość przerwy pozwala na umieszczenie cząsteczki oligosacharydu zawierającej 6 reszt monosacharydowych. Nie jest możliwe ustalenie charakteru wiązania substratu, na przykład heksasacharydu NAG6, metodą analizy dyfrakcji rentgenowskiej. Jednocześnie kompleksy enzymu z inhibitorem trisacharydu NAG 3 są stabilne i dobrze przebadane. NAG 3 wiąże się w szczelinie na powierzchni enzymu, tworząc wiązania wodorowe i kontakty van der Waalsa; jednocześnie wypełnia tylko połowę luki, w której mogą się związać jeszcze trzy reszty monosacharydowe. Koniec nieredukujący (cukier A) znajduje się na początku przerwy, a koniec redukujący (cukier C) w jej środkowej części; reszty cukrowe A, B i C mają konformację krzesła. Konstrukcję modelu kompleksu enzym-substrat oparto na założeniu, że przy wiązaniu substratu NAG 6 zachodzą takie same oddziaływania jak przy wiązaniu NAG 3 . W modelu enzymatycznym wewnątrz przerwy umieszczono trzy reszty cukrowe (określane jako reszty D, E i F); każdy kolejny cukier był przyłączany w taki sposób, że jego konformacja była taka sama (na ile to możliwe) jak pierwszych trzech cukrów. Jako część kompleksu modelowego, wszystkie reszty cukrowe realizują efektywne niekowalencyjne interakcje z bocznymi i peptydowymi grupami reszt aminokwasowych, które tworzą lukę.
Identyfikując grupy katalityczne, naturalne było skupienie się na tych, które znajdują się w kompleksie enzym-substrat w pobliżu rozszczepialnego wiązania glikozydowego i mogą służyć jako donory lub akceptory protonów. Okazało się, że po jednej stronie rozszczepionego wiązania, w pewnej odległości? 0,3 nm (od tlenu wiązania glikozydowego) znajduje się grupa karboksylowa Glu-35, a z drugiej (w tej samej odległości) grupa karboksylowa Asp-52, ich środowisko jest bardzo różne. Glu-35 jest otoczony resztami hydrofobowymi; można przyjąć, że przy optymalnym pH enzymu grupa ta jest w stanie niezjonizowanym. Środowisko Asp-52 jest wyraźnie polarne; jego grupa karboksylowa uczestniczy jako akceptor wodoru w złożonej sieci wiązań wodorowych i prawdopodobnie działa w stanie zjonizowanym.
Zaproponowano następujący schemat procesu katalitycznego podczas hydrolizy oligosacharydu. Niezjonizowana grupa karboksylowa Glu-35 działa jako donor protonów, dostarczając ją do glikozydowego atomu tlenu między atomem C (1) cukru D a atomem C (4) cukru E (ogólny etap katalizy kwasowej); powoduje to zerwanie wiązania glikozydowego. W efekcie reszta cukrowa D przechodzi w stan karbokationu z dodatnio naładowanym atomem węgla C (1) i przyjmuje konformację półkrzesła. Ujemny ładunek grupy karboksylanowej Asp-52 stabilizuje karbokation. Pozostała część NAG 2 (cukry E+F) dyfunduje z regionu miejsca aktywnego. Następnie do reakcji wchodzi cząsteczka wody; jego proton przechodzi do Glu-35, a grupa OH - do atomu C(1) reszty D (etap katalizy zasadowej). Reszta NAG 4 (cukry A + B + C + D) opuszcza obszar centrum aktywnego, a enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Rybonukleaza (RNaza) bydlęcej trzustki hydrolizuje wiązania międzynukleotydowe w RNA w pobliżu jednostek pirymyliny, które pozostają zestryfikowane w pozycji 3". Enzym ten, wraz z innymi nukleazami, jest szeroko stosowany w analizie struktury RNA.
RNaza składa się z jednego łańcucha polipeptydowego zawierającego 124 reszty aminokwasowe, a jej masa cząsteczkowa wynosi 13 680; W cząsteczce znajdują się cztery wiązania dwusiarczkowe. RNaza jest pierwszym enzymem, dla którego ustalono strukturę pierwszorzędową.
Opierając się na wynikach badań renaturacji rybonukleazy, K. Afinsen po raz pierwszy jasno sformułował ideę, że struktura przestrzenna białka jest zdeterminowana przez jego strukturę pierwszorzędową.
W 1958 roku F. Richards wykazał, że w pewnych warunkach subtilizyna rozszczepia wiązanie peptydowe Ala-20 - Ser-21 w RNazie. Otrzymane fragmenty nazwano peptydem S (reszty 1-20) i białkiem S (reszty 21-124); dzięki oddziaływaniom niekowalencyjnym fragmenty tworzą kompleks zwany RNazą S. Kompleks ten ma prawie pełną aktywność katalityczną natywnego enzymu; w postaci wyizolowanej peptyd S i białko S są nieaktywne. Ponadto stwierdzono, że syntetyczny peptyd identyczny w sekwencji z fragmentem peptydu S zawierającym reszty 1 do 13 przywraca aktywność białka S, ale krótszy peptyd zawierający reszty 1 do 11 nie ma takiej zdolności. Uzyskane dane pozwoliły nam stwierdzić, że odpowiednie reszty His-12 lub Met-13 (lub obie te reszty) są zawarte w miejscu aktywnym enzymu.
Badając wpływ pH na aktywność RNazy, wyjaśniono ważną rolę grup funkcyjnych białek o pK 5,2 i 6,8; sugerowało to udział reszt histydyny w procesie katalitycznym.
Po karboksylacji RNazy jodooctanem przy pH 5,5, tj. w warunkach, w których zachodzi głównie modyfikacja reszt histydyny, obserwowano całkowitą utratę aktywności; zmodyfikowany enzym zawiera 1 mol grup karboksymetylowych na 1 mol białka. W rezultacie powstają dwie formy monokarboksymetylenowe enzymu. W jednej postaci His-12 jest karboksymetylowany, aw drugiej His-119. His-119 został w większości zmodyfikowany.
Dane te sugerują, że His-12 i His-119 znajdują się w miejscu aktywnym i że modyfikacja jednego z nich zapobiega modyfikacji drugiego.
W wyniku badań dyfrakcji rentgenowskiej wyjaśniono budowę przestrzenną RNazy S oraz kompleksu RNazy S z inhibitorami. Cząsteczka ma kształt nerki, centrum aktywne zlokalizowane jest w zagłębieniu, w którym znajdują się pozostałości His-12, His-119 i Lys-41.
Hydroliza zachodzi w wyniku sprzężonego działania reszt His-12 i His-119, które przeprowadzają katalizę kwasowo-zasadową. Poniższy schemat przedstawia etapy procesu katalitycznego:
1. Substrat znajduje się w miejscu aktywnym; His-12, His-119 i Lys-41 znajdują się w pobliżu ujemnie naładowanego fosforanu.
2. W wyniku działania His-12 jako zasady przyjmującej proton z grupy 2"-OH rybozy oraz His-119 jako kwasu oddającego proton atomowi tlenu fosforanu, powstaje związek pośredni najpierw tworzy się kompleks, a następnie 2", 3"-cykliczny fosforan.
3. W miejsce odchodzącego produktu wchodzi woda, oddając proton His-119 i OH do fosforanu, w tym samym czasie proton z His-12 przechodzi do atomu tlenu rybozy, powstaje drugi produkt i enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Chymotrypsyna jest wydzielana w postaci proenzymu - chymotrypsynogenu przez trzustkę kręgowców; aktywacja proenzymu zachodzi w dwunastnicy pod wpływem trypsyny. Fizjologiczną funkcją chymotrypsyny jest hydroliza białek i polipeptydów. Chymotrypsyna atakuje głównie wiązania peptydowe utworzone przez reszty karboksylowe tyrozyny, tryptofanu, cenylalaniny i metionaniny. Skutecznie hydrolizuje również estry odpowiednich aminokwasów. Masa cząsteczkowa chymotrypsyny wynosi 25 000, cząsteczka zawiera 241 reszt aminokwasowych. Chymotrypsyna składa się z trzech łańcuchów polipeptydowych połączonych mostkami dwusiarczkowymi.
Grupy funkcyjne miejsca aktywnego chymotrypsyny zidentyfikowano za pomocą nieodwracalnych inhibitorów. Resztę Ser-195 zmodyfikowano fluorofosforanem diizopropylu i fenylometylosulfofluorkiem, a resztę His-122 zmodyfikowano ketonem N-tosylo-L-fenyloalaniny chlorometylu. Dwuetapowy proces hydrolizy chymotrypsyny odkryto w badaniu kinetyki hydrolizy octanu p-nitrofenylu.
Cechą charakterystyczną rozważanego procesu jest powstawanie kowalencyjnego związku pośredniego, enzymu acylowego. Acylowaną grupę katalityczną zidentyfikowano jako resztę Ser-195. Mechanizm katalizy przeprowadzanej przez enzym został zaproponowany jeszcze przed ustaleniem struktury przestrzennej białka, ale później został dopracowany. W szczególności badania z użyciem 18 H 2 O umożliwiły udowodnienie powstawania enzymu acylowego podczas hydrolizy peptydów.
Trójwymiarową strukturę o rozdzielczości 0,2 nm ustalono za pomocą analizy dyfrakcji rentgenowskiej D. Blowa. w 1976 roku Cząsteczka ma kształt elipsoidy o osiach 5,4*4*4 nm. Wyniki badań krystalograficznych potwierdziły przypuszczenie, że reszty Ser-195 i His-57 są zbliżone. Grupa hydroksylowa Ser-195 znajduje się w odległości ~ 0,3 nm na północ od atomu azotu pierścienia imidazolu His-57. Najbardziej interesującym faktem było to, że atom azotu w pozycji 1 pierścienia znajduje się w odległości ~0,28 nm od atomu tlenu grupy karboksylowej łańcucha bocznego Asp-102 i zajmuje pozycję sprzyjającą powstawaniu wodoru obligacja.
Należy zaznaczyć, że badania chemiczne nie wykazały udziału Asp-102 w funkcjonowaniu centrum aktywnego, ponieważ pozostałość ta jest osadzona głęboko w cząsteczce.
Obecnie uważa się, że trzy reszty Asp-102, His-57 i Ser-195 tworzą system przenoszenia ładunku, który odgrywa kluczową rolę w procesie katalizy. Funkcjonowanie układu zapewnia efektywny udział His-57 w katalizie jako katalizatora kwasowo-zasadowego oraz zwiększa reaktywność Ser-195 do węgla karboksylowego atakowanego wiązania.
Kluczowym elementem katalizy jest przeniesienie protonu z Ser-195 do His-57. W tym samym czasie atom tlenu seryny atakuje karbonylowy atom węgla substratu, tworząc najpierw pośredni związek tetraedryczny (1), a następnie enzym acylowy (2). Kolejnym etapem jest deacylacja. Cząsteczka wody wchodzi do układu przenoszenia ładunku, a jon OH jednocześnie atakuje karbonylowy atom węgla grupy acylowej enzymu acylowego. Podobnie jak w etapie acylowania, powstaje pośredni związek tetraedryczny (4). His-57 przekazuje następnie proton atomowi tlenu Ser-195, uwalniając produkt acylowy; dyfunduje do roztworu, a enzym powraca do swojego pierwotnego stanu.
Karboksypeptydaza A jest wydzielana jako proenzym przez trzustkę kręgowców. Tworzenie aktywnego enzymu zachodzi w jelicie cienkim przy udziale chymotrypsyny. Enzym sekwencyjnie odcina C-końcowe reszty aminokwasowe z łańcucha peptydowego, tj. jest egzopeptydazą.
Karboksypeptydaza A jest utworzona przez pojedynczy łańcuch polipeptydowy zawierający 307 reszt aminokwasowych; masa cząsteczkowa wynosi 34 470. Sekwencję aminokwasową białka ustalił w 1969 r. R. Bredshaw.
Wyjaśnienie mechanizmu działania enzymu było możliwe dopiero po przeprowadzeniu badań dyfrakcji rentgenowskiej. Strukturę przestrzenną enzymu i jego kompleksu z dipeptydem Gly-Tyr (model substratowy) ustalił W. Lipscomb. Cząsteczka enzymu ma kształt elipsoidy o osiach 5,0*4,2*3,8 nm; centrum aktywne znajduje się w zagłębieniu przechodzącym w głęboką kieszeń niepolarną. W strefie centrum aktywnego zlokalizowany jest jon cynku (jego ligandami są łańcuchy boczne reszt Glu-72, His196, His-69 i cząsteczka wody), a także grupy funkcyjne zaangażowane w wiązanie substratu i katalizę - Arg-145, Glu-270 i Tyr-248.
Analiza porównawcza struktury enzymu i jego kompleksu z Gly-Tyr dostarczyła ważnych informacji na temat struktury kompleksu enzym-substrat. W szczególności stwierdzono, że podczas tworzenia kompleksu grupa hydroksylowa Tyr-248 przesuwa się o 1,2 nm względem swojej pozycji w wolnym enzymie (tj. o około 1/3 średnicy cząsteczki).
Zgodnie ze schematem procesu katalitycznego, grupa karboksylanowa Glu-270 aktywuje cząsteczkę wody znajdującą się w sferze reakcyjnej, wyciągając z niej proton; powstały jon OH- przeprowadza atak nukleofilowy na węgiel karbonylowy rozszczepialnego wiązania. Jednocześnie grupa hydroksylowa Tyr-248, znajdująca się w pobliżu atomu azotu rozszczepialnego wiązania peptydowego, przekazuje mu proton. W rezultacie zaatakowane wiązanie peptydowe zostaje rozerwane, a powstałe produkty opuszczają strefę miejsca aktywnego. Poniższy schemat ilustruje ogólną podstawową katalizę.
Aminotransferaza asparaginianowa katalizuje odwracalną reakcję transaminacji.
Enzymatyczna reakcja transaminacji została odkryta przez A.E. Braunsteina i M.G. Kritzmana w 1937 roku w badaniu preparatu enzymatycznego z mięśnia gołębia. W kolejnych badaniach wykazano, że reakcje transaminacji są szeroko rozpowszechnione u dzikich zwierząt i odgrywają ważną rolę w sprzęganiu metabolizmu azotu i energii.
W 1945 roku stwierdzono, że pirydoksalo-5"-fosforan (PLP) jest koenzymem aminotransferaz. Cząsteczka AAT jest dimerem utworzonym z identycznych podjednostek. W mięśniu sercowym badanych kręgowców występują dwa izoenzymy - cytoplazmatyczny (cAAT0 ) i aminotransferazy mitochondrialne (mAAT).
Pierwszorzędowa struktura cAAT z mięśnia sercowego została ustalona w 1972 roku. Yu.A. Ovchinnikov i A.E. Brainsteina. Łańcuch polipeptydowy białka zawiera 412 reszt aminokwasowych; masa cząsteczkowa wynosi 46 000.
Ogólna teoria katalizy pirydoksalu została opracowana przez A.E. Braunstein i M.M. Shemyakin w latach 1952-1953, a nieco później - D.E. Metzler i E.E. Snel. Zgodnie z tą teorią katalityczne działanie enzymów pirydoksalu wynika ze zdolności grupy aldehydowej fosforanu pirydoksalu do tworzenia aldimin (zasad Schiffa) podczas interakcji z aminami, w tym aminokwasami.
W powstałym fosfopirydoksyldenoaminokwasie występuje układ sprzężonych wiązań podwójnych, wzdłuż których wypieranie elektronów z atomu węgla 6 ułatwia rozrywanie wiązań tworzonych przez ten atom.
Współczesne koncepcje dotyczące mechanizmu transaminacji enzymatycznej opracowane przez A.E. Braunstein i jego współpracownicy są rozwinięciem powyższej teorii. W stanie początkowym grupa aldehydowa fosforanu pirydoksalu tworzy wiązanie aldiminowe z grupą e-aminową reszty Lys-258 centrum aktywnego (I). Po związaniu aminokwasu tworzy się kompleks Michaelisa (II), a następnie aldimina pomiędzy fosforanem pirydoksalu i substratem (III). W wyniku kolejnych przemian poprzez stadia pośrednie (IV) i (V) powstaje oksokwas (VI). To kończy pierwszą połowę reakcji transaminacji. Powtarzanie tych samych kroków w „odwrotnym” kierunku z nowym hydroksykwasem stanowi drugą połówkę reakcji, która kończy cykl katalitycznej transaminacji.
Mioglobina i hemoglobina
Te dwa białka są często określane jako enzymy oddechowe. Ich oddziaływanie z podłożem, tlenem, zostało szczegółowo wyjaśnione, głównie na podstawie analizy dyfrakcji rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości. Trójwymiarową strukturę mioglobiny określił J. Kendrew w 1961 r., a trójwymiarową strukturę hemoglobiny M. Perutz w 1960 r.
Cząsteczka mioglobiny ma zwarty kształt - 4,5 * 3,5 * 2,5 nm, łańcuch polipeptydowy tworzy 8 spiralnych odcinków, oznaczonych literami od A do H. Ułożony jest w wyspecjalizowany sposób wokół dużego płaskiego pierścienia hemowego zawierającego żelazo. Hem to kompleks porfiryny z żelazem.
Polarne łańcuchy hemu kwasu propionowego znajdują się na powierzchni cząsteczki, reszta hemu jest osadzona w globuli. Połączenie hemu z białkiem odbywa się dzięki wiązaniu koordynacyjnemu między atomem żelaza a atomem histydyny, zlokalizowane w helisie F; jest to tak zwana proksymalna histydyna. Inna ważna reszta histydyny, dystalna histydyna, jest zlokalizowana w kieszeni hemu w helisie E; znajduje się po przeciwnej stronie atomu żelaza w większej odległości niż proksymalna histydyna. Region pomiędzy genem żelaza a dystalną histydyną w dezoksymioglobinie jest wolny, a lipofilowa cząsteczka O2 może wiązać się z żelazem hemowym, zajmując szóstą pozycję koordynacyjną. Unikalną cechą mioglobiny, podobnie jak hemoglobiny, jest ich zdolność do odwracalnego wiązania O 2 bez utleniania hemu Fe 2+ do Fe 3+ . Jest to możliwe, ponieważ w hydrofobowej kieszeni hemowej, z której wypierana jest woda, tworzy się ośrodek o niskiej przenikalności.
Kiedy O2 jest związany z atomem żelaza, ten ostatni porusza się o około 0,06 nm i kończy w płaszczyźnie pierścienia porfiryny, tj. w korzystniejszej energetycznie pozycji. Uważa się, że ruch ten wynika z faktu, że jon Fe 2+ w deoksymioglobinie znajduje się w stanie wysokospinowym, a jego promień jest zbyt duży, aby zmieścił się w płaszczyźnie pierścienia hemu porfiryny. Kiedy O2 jest związany, jon Fe2+ przechodzi w stan niskiego pinu i jego promień maleje; teraz jon Fe 2+ może przenieść się do płaszczyzny pierścienia porfirynowego.
Hemoglobina jest głównym składnikiem czerwonych krwinek, który dostarcza tlen z płuc do tkanek i dwutlenek węgla z tkanek do płuc. Hemoglobiny różnych typów różnią się postacią kryształów, rozpuszczalnością, powinowactwem do tlenu. Wynika to z różnic w sekwencji aminokwasów białek; składnik hemu jest taki sam w hemoglobinach wszystkich gatunków kręgowców i niektórych bezkręgowców.
Hemoglobina ludzka jest tetramerem składającym się z czterech podjednostek, dwóch podjednostek b i dwóch podjednostek b, z których każda zawiera odpowiednio 141 i 146 reszt aminokwasowych. Istnieje znaczna homologia między pierwszorzędowymi strukturami podjednostek β i β, a konformacja ich łańcuchów polipeptydowych jest również podobna.
Cząsteczka hemoglobiny ma kulisty kształt o średnicy 5,5 nm. Cztery podjednostki są upakowane w czworościenny kształt.
Dane z dyfrakcji rentgenowskiej wykazały, że utlenianiu hemoglobiny towarzyszy szereg zmian. Przy niskiej rozdzielczości stwierdzono, że w tym przypadku struktura staje się bardziej zwarta (atomy Fe łańcuchów β zbliżają się do siebie o około 0,6-0,7 nm), podjednostki obracają się względem siebie, a oś drugiego rzędu o 10-15 godz. Wyniki badania w wysokiej rozdzielczości wskazują, że szczególnie istotne zmiany zachodzą w rejonie styków 6V.
Do chwili obecnej na podstawie badań dyfrakcji rentgenowskiej oraz szeregu innych podejść metodologicznych dokonano znacznego postępu w wyjaśnianiu mechanizmu działania enzymów o pożądanych właściwościach w oparciu o osiągnięcia inżynierii genetycznej. Otwiera to szerokie możliwości sprawdzenia słuszności współczesnych poglądów na temat mechanizmu działania enzymów i stworzenia fundamentalnej teorii katali enzymatycznych.