Polarizovana mikroskopija. Vizualizacija intracelularnih struktura mikroorganizama pomoću svjetlosne mikroskopije. Metoda faznog kontrastnog mikroskopa
![Polarizovana mikroskopija. Vizualizacija intracelularnih struktura mikroorganizama pomoću svjetlosne mikroskopije. Metoda faznog kontrastnog mikroskopa](https://i0.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/211.jpg)
Polarizaciona mikroskopija omogućava vam da dobijete slike neobojenih anizotropnih struktura (na primjer, kolagena vlakna, miofibrile ili mikrobne ćelije). Princip metode zasniva se na proučavanju objekta u svjetlosti koju čine dva zraka polarizirana u međusobno okomitim ravninama.
Rice. 11-4. Dijagram fluorescentnog mikroskopa.Interferencijalna mikroskopija
Interferencijalna mikroskopija kombinuje principe fazno-kontrastne i polarizacione mikroskopije. Metoda se koristi za dobivanje kontrastne trodimenzionalne slike neobojenih objekata. Princip metode se zasniva na cijepanju svjetlosnog toka u mikroskopu; jedna zraka prolazi kroz objekat, druga - pored njega. Oba snopa su povezana na okularu i interferiraju jedan s drugim.
![](https://i0.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/211.jpg)
Fluorescentna mikroskopija
Metoda fluorescentne mikroskopije zasnovano na sposobnosti nekih supstanci da sijaju kada su izložene kratkotalasnom zračenju. U ovom slučaju, emitovani svetlosni talasi su duži od talasa koji izaziva sjaj. Drugim rečima, fluorescentni objekti apsorbuju svetlost jedne talasne dužine i emituju svetlost u drugom delu spektra (slika 11-4). Na primjer, ako je induktivno zračenje plavo, onda rezultirajući sjaj može biti crven ili žut. Ove supstance (fluorescein izocijanat, akridin narandža, rodamin, itd.) koriste se kao fluorescentne boje za posmatranje fluorescentnih (luminiscentnih) objekata. U fluorescentnom mikroskopu, svjetlost iz izvora (živine lampe ultra visokog pritiska) prolazi kroz dva filtera.
![](https://i2.wp.com/meduniver.com/Medical/Microbiology/Img/212.jpg)
Prvi (plavi) filter hvata svjetlost ispred uzorka i prenosi svjetlost talasne dužine koja pobuđuje fluorescenciju uzorka. Druga (žuta) blokira plavo svjetlo, ali prenosi žutu, crvenu, zelenu svjetlost koju emituje fluorescentni objekt i koju opaža oko. Obično se mikroorganizmi koji se proučavaju boje direktno ili pomoću AT ili lektina označenih fluorohromima. Lijekovi stupaju u interakciju sa Ag ili drugim ligand-vezujućim strukturama objekta. Fluorescentna mikroskopija je našla široku primenu za vizuelizaciju rezultata imunohemijskih reakcija na osnovu specifične interakcije AT obeleženog fluorescentnim bojama sa Ag proučavanog objekta. Opcije imunofluorescentne reakcije predstavljeni su na sl. 11-5 i 11-6.
Pošaljite svoj dobar rad u bazu znanja je jednostavno. Koristite obrazac ispod
Studenti, postdiplomci, mladi naučnici koji koriste bazu znanja u svom studiranju i radu biće vam veoma zahvalni.
Objavljeno na http://www.allbest.ru/
Uvod
Svetlosna mikroskopija
Elektronska mikroskopija
Polarizaciona mikroskopija
Aneks 1
Svetlosna mikroskopija
Svetlosna mikroskopija je najstarija i ujedno jedna od najčešćih metoda za proučavanje i proučavanje biljnih i životinjskih ćelija. Pretpostavlja se da je početak proučavanja ćelija bio upravo pronalaskom svjetlosnog optičkog mikroskopa. Glavna karakteristika svjetlosnog mikroskopa je rezolucija svjetlosnog mikroskopa, koja je određena talasnom dužinom svjetlosti. Granica rezolucije svjetlosnog mikroskopa određena je talasnom dužinom svjetlosti; optički mikroskop se koristi za proučavanje struktura koje imaju minimalne dimenzije jednake talasnoj dužini svjetlosnog zračenja. Mnoge sastavne ćelije su slične po optičkoj gustoći i zahtevaju prethodnu obradu pre mikrokopiranja, inače su praktično nevidljive pod konvencionalnim svetlosnim mikroskopom. Kako bi bili vidljivi, koriste se različite boje određene selektivnosti. Koristeći selektivne boje, postaje moguće detaljnije proučavati unutrašnju strukturu ćelije.
Na primjer:
hematoksilinska boja neke komponente jezgra boji plavo ili ljubičasto;
nakon tretmana uzastopno s floroglucinolom, a zatim sa hlorovodoničnom kiselinom, lignificirane ćelijske membrane postaju trešnje crvene;
Sudan III boja boji suberizirane ćelijske membrane u ružičasto;
slab rastvor joda u kalijum jodidu pretvara škrobna zrna u plavo.”
Prilikom mikroskopskih pregleda, većina tkiva se fiksira prije bojenja.
Jednom fiksirane, ćelije postaju propusne za boje i ćelijska struktura se stabilizuje. Jedan od najčešćih fiksatora u botanici je etil alkohol.
Prilikom pripreme preparata za mikrokopiranje na mikrotomu se izrađuju tanki rezovi (Prilog 1, sl. 1). Ovaj uređaj koristi princip rezanja kruha. Za biljna tkiva se prave nešto deblji rezovi nego za životinjska jer su biljne ćelije relativno veće. Debljina presjeka biljnog tkiva za - 10 mikrona - 20 mikrona. Neke su maramice previše mekane da bi se mogle odmah rezati. Stoga se nakon fiksiranja ulijevaju u rastopljeni parafin ili posebnu smolu, koja zasićuje cijelu tkaninu. Nakon hlađenja formira se čvrsti blok koji se zatim reže mikrotomom. Ovo se objašnjava činjenicom da biljne ćelije imaju jake ćelijske zidove koji čine okvir tkiva. Lignificirane školjke su posebno jake.
Prilikom upotrebe punjenja tokom pripreme, rez postoji rizik od oštećenja strukture ćelije, da biste to spriječili, koristite metodu brzog zamrzavanja. Kada koristite ovu metodu, možete bez fiksiranja i punjenja. Zamrznuto tkivo se reže pomoću posebnog mikrotoma - kriotoma (Dodatak 1, sl. 2).
Zamrznuti dijelovi bolje čuvaju prirodne strukturne karakteristike. Međutim, teže ih je kuhati, a prisustvo kristala leda uništava neke od detalja.
fazni kontrast (Dodatak 1, slika 3) i interferentni mikroskopi (Dodatak 1, slika 4) omogućavaju vam da pregledate žive ćelije pod mikroskopom sa jasnim ispoljavanjem detalja njihove strukture. Ovi mikroskopi koriste 2 snopa svjetlosnih valova koji međusobno djeluju (superponiraju), povećavajući ili smanjujući amplitudu valova koji ulaze u oko iz različitih komponenti ćelije.
Svetlosna mikroskopija ima nekoliko varijanti.
Metoda svijetlog polja i njene varijante
Metoda transmitiranog svjetlosnog polja koristi se u proučavanju prozirnih preparata koji sadrže čestice i detalje koji upijaju svjetlost (tanki obojeni dijelovi životinjskog i biljnih tkiva, tanki dijelovi minerala). U nedostatku lijeka, snop svjetlosti iz kondenzatora, koji prolazi kroz sočivo, proizvodi jednoliko osvijetljeno polje u blizini fokalne ravni okulara. Ako se u preparatu nalazi upijajući element, dolazi do djelomične apsorpcije i djelomičnog raspršivanja svjetlosti koja pada na njega, što uzrokuje pojavu slike. Metodu je moguće koristiti i pri promatranju neupijajućih objekata, ali samo ako raspršuju svjetlosni snop toliko jako da njegov značajan dio ne pada u sočivo.
Metoda kosog osvjetljenja- varijacija prethodne metode. Razlika između njih je u tome što je svjetlost usmjerena na objekt pod velikim uglom u odnosu na smjer promatranja. Ponekad to pomaže da se otkrije "reljef" objekta zbog stvaranja sjenki.
Metoda svijetlog polja u reflektiranoj svjetlosti koristi se pri proučavanju neprozirnih objekata koji reflektiraju svjetlost, kao što su tanki profili metala ili ruda. Preparat se osvjetljava (iz iluminatora i prozirnog ogledala) odozgo, kroz sočivo, koje istovremeno ima i ulogu kondenzatora. Na slici koju u ravnini stvara sočivo zajedno sa cijevnim sočivom vidljiva je struktura preparata zbog razlike u refleksivnosti njegovih elemenata; U svijetlom polju se također ističu nehomogenosti koje raspršuju svjetlost koja pada na njih.
Metoda tamnog polja i njene varijacije
Metoda prenošenog svijetla tamnog polja koristi se za dobivanje slika prozirnih, neupijajućih objekata koji se ne mogu vidjeti korištenjem metode svijetlog polja. Često su to biološki objekti. Svjetlost iz iluminatora i ogledala usmjerava se na preparat posebno dizajniranim kondenzatorom - tzv. kondenzator tamnog polja. Po izlasku iz kondenzatora, glavni dio svjetlosnih zraka, koji nije promijenio smjer prilikom prolaska kroz prozirni preparat, formira snop u obliku šupljeg stošca i ne ulazi u sočivo (koje se nalazi unutar ovog konusa) . Slika u mikroskopu se formira koristeći samo mali dio zraka raspršenih mikročesticama lijeka koje se nalaze na stakalcu u konus i prolaze kroz sočivo. U vidnom polju na tamnoj pozadini vidljive su svijetle slike strukturnih elemenata lijeka, koji se po indeksu prelamanja razlikuju od okolnog okruženja. Velike čestice imaju samo svijetle ivice koje rasipaju svjetlosne zrake. Koristeći ovu metodu, nemoguće je po izgledu slike utvrditi da li su čestice prozirne ili neprozirne, odnosno da li imaju veći ili manji indeks loma u odnosu na okolni medij.
Elektronska mikroskopija
Prvi elektronski mikroskop konstruisali su Knoll i Ruska 1931. godine u Nemačkoj. Tek 50-ih godina razvijene su metode za proizvodnju profila potrebnih kvaliteta.
Poteškoće elektronske mikroskopije su u tome što je za proučavanje bioloških uzoraka neophodna posebna obrada preparata.
Prva poteškoća je što elektroni imaju vrlo ograničenu moć prodiranja, pa se moraju pripremiti ultratanke preseke debljine 50 - 100 nm. Da bi se dobili tako tanki rezovi, tkivo se prvo impregnira smolom: smola se polimerizuje i formira čvrsti plastični blok. Zatim, pomoću oštrog staklenog ili dijamantskog noža, sekcije se režu na posebnom mikrotomu.
Postoji još jedna poteškoća: kada elektroni prolaze kroz biološko tkivo, kontrastna slika se ne dobija. Kako bi se dobio kontrast, tanki rezovi bioloških uzoraka su impregnirani solima teških metala.
Postoje dvije glavne vrste elektronskih mikroskopa. U transmisionom (transmisionom) mikroskopu, snop elektrona, prolazeći kroz posebno pripremljen uzorak, ostavlja svoju sliku na ekranu. Rezolucija modernog transmisionog elektronskog mikroskopa je skoro 400 puta veća od rezolucije svjetlosti. Ovi mikroskopi imaju rezoluciju od oko 0,5 nm.
Uprkos tako visokoj rezoluciji, transmisioni elektronski mikroskopi imaju velike nedostatke:
morate raditi sa fiksnim materijalima;
slika na ekranu je dvodimenzionalna (ravna);
Kada se tretiraju teškim metalima, neke ćelijske strukture se uništavaju i modificiraju.
Trodimenzionalna (volumetrijska) slika se dobija pomoću skenirajućeg elektronskog mikroskopa (EM). Ovdje snop ne prolazi kroz uzorak, već se odbija od njegove površine.
Ispitni uzorak se fiksira i suši, nakon čega se prekriva tankim slojem metala, operacija koja se naziva sjenčanje (uzorak se zasjenjuje).
Kod skeniranja EM, fokusirani snop elektrona se usmjerava na uzorak (uzorak se skenira). Kao rezultat, metalna površina uzorka emituje sekundarne elektrone niske energije. Oni se snimaju i pretvaraju u sliku na televizijskom ekranu. Maksimalna rezolucija skenirajućeg mikroskopa je mala, oko 10 nm, ali je slika trodimenzionalna.
Vrste elektronske mikroskopije:
Amplitudna elektronska mikroskopija- Metode amplitudne elektronske mikroskopije mogu se koristiti za obradu slika amorfnih i drugih tijela (čije su veličine čestica manje od udaljenosti razlučene u elektronskom mikroskopu) koja difuzno raspršuju elektrone. U transmisijskom elektronskom mikroskopu, na primjer, kontrast slike, odnosno razlika u svjetlini slike susjednih područja objekta, je u prvoj aproksimaciji proporcionalna razlici u debljini ovih područja.
Fazna elektronska mikroskopija- Za izračunavanje kontrasta slika kristalnih tijela pravilne strukture, kao i za rješavanje inverznog problema - izračunavanje strukture objekta na osnovu posmatrane slike - koriste se metode fazne elektronske mikroskopije. Razmatra se problem difrakcije elektronskog talasa na kristalnoj rešetki, čije rešenje dodatno uzima u obzir neelastične interakcije elektrona sa objektom: rasejanje plazmama, fononima itd. U transmisionim elektronskim mikroskopima i skeniranju visoke rezolucije elektronskim mikroskopom se dobijaju slike pojedinačnih molekula ili atoma teških elemenata. Koristeći metode fazne elektronske mikroskopije, moguće je rekonstruisati trodimenzionalnu strukturu kristala i bioloških makromolekula sa slika.
Kvantitativna elektronska mikroskopija- Metode kvantitativne elektronske mikroskopije su precizno mjerenje različitih parametara uzorka ili procesa koji se proučava, na primjer, mjerenje lokalnih električnih potencijala, magnetnih polja, mikrogeometrija površinskog reljefa itd.
Lorentz elektronska mikroskopija- Područje proučavanja Lorentzove elektronske mikroskopije, u kojoj se proučavaju fenomeni uzrokovani Lorentzovom silom, su unutrašnja magnetna i električna polja ili vanjska lutajuća polja, na primjer polja magnetnih domena u tankim filmovima, feroelektrične domene, polja glava za magnetno snimanje informacija itd.
Polarizaciona mikroskopija
Polarizaciona mikroskopija je metoda promatranja u polariziranom svjetlu za mikroskopsko ispitivanje preparata koji sadrže optički anizotropne elemente (ili se u potpunosti sastoje od takvih elemenata). To uključuje mnoge minerale, zrna u tankim slojevima legura, neka životinjska i biljna tkiva, itd. Posmatranje se može vršiti iu propuštenom i reflektovanom svjetlu. Svjetlost koju emituje iluminator prolazi kroz polarizator. Polarizacija koja mu je data mijenja se s naknadnim prolaskom svjetlosti kroz preparat (ili refleksijom od njega). Ove promjene se proučavaju pomoću analizatora i različitih optičkih kompenzatora. Analizom ovakvih promjena mogu se suditi o glavnim optičkim karakteristikama anizotropnih mikroobjekata: jačini dvoloma, broju optičkih osi i njihovoj orijentaciji, rotaciji ravni polarizacije i dikroizmu.
Metoda faznog kontrasta
Metoda fazni kontrast i njenu raznolikost - tzv. metoda "anoptralni" kontrast dizajnirani su za dobijanje slika prozirnih i bezbojnih objekata koji su nevidljivi kada se posmatraju metodom svijetlog polja. To uključuje, na primjer, živa neobojena životinjska tkiva. Suština metode je da čak i sa vrlo malim razlikama u indeksima prelamanja različitih elemenata preparata, svjetlosni val koji prolazi kroz njih prolazi kroz različite promjene faze (stiče tzv. fazni reljef). Ne percipirane direktno ni okom ni fotografskom pločom, ove promjene faze se uz pomoć posebnog optičkog uređaja pretvaraju u promjene amplitude svjetlosnog vala, odnosno u promjene svjetline („amplituda reljefa“), koje se već vidljive oku ili snimljene na fotoosjetljivom sloju. Drugim riječima, u rezultirajućoj vidljivoj slici, raspodjela svjetline (amplituda) reproducira fazni reljef. Slika dobijena na ovaj način naziva se fazni kontrast.
Tipičan radni dijagram metode: dijafragma s otvorom ugrađena je u prednji fokus kondenzatora, čija rupa ima oblik prstena. Njegova slika se pojavljuje u blizini stražnjeg fokusa sočiva, a tzv. fazna ploča na čijoj se površini nalazi prstenasto izbočenje ili prstenasti žlijeb, koji se naziva fazni prsten. Fazna ploča nije uvijek postavljena u fokusu sočiva - često se fazni prsten nanosi direktno na površinu jednog od objektiva.
U svakom slučaju, zraci iz iluminatora koji se ne odbiju u preparatu, dajući sliku dijafragme, moraju u potpunosti proći kroz fazni prsten, što ih značajno slabi (čini se apsorbujućim) i mijenja njihovu fazu za l/4 (l je talasna dužina svetlosti). A zraci, čak i malo skrenuti (raspršeni) u preparatu, prolaze kroz faznu ploču, zaobilazeći fazni prsten i ne prolaze kroz dodatni fazni pomak.
Uzimajući u obzir fazni pomak u pripremnom materijalu, ukupna fazna razlika između otklonjenih i nedevijairanih snopova je blizu 0 ili l/2, a kao rezultat interferencije svjetlosti u ravni slike preparata, oni primjetno pojačavaju ili slabe jedno drugo, dajući kontrastnu sliku strukture preparata. Odbijene zrake imaju znatno manju amplitudu u odnosu na one bez devijacije, stoga slabljenje glavnog snopa u faznom prstenu, približavanje vrijednosti amplitude, također dovodi do većeg kontrasta slike.
Metoda omogućava razlikovanje malih strukturnih elemenata koji su izuzetno niskog kontrasta u metodi svijetlog polja. Prozirne čestice, koje su relativno male veličine, raspršuju svjetlosne zrake pod tako malim uglovima da ti zraci prolaze zajedno sa onima koji nisu odbijeni kroz fazni prsten. Za takve čestice, efekat faznog kontrasta se javlja samo u blizini njihovih kontura, gdje dolazi do snažnog raspršenja.
Metoda infracrvenog posmatranja
Metoda posmatranja u infracrvenom spektru(IR) zraci također zahtijevaju pretvaranje slike nevidljive oku u vidljivu pomoću fotografije ili pomoću elektronsko-optičkog pretvarača. IC mikroskopija omogućava proučavanje unutrašnje strukture objekata koji su neprozirni u vidljivoj svjetlosti, kao što su tamna stakla, neki kristali i minerali itd.
Metoda ultraljubičastog posmatranja
Metoda posmatranja u ultraljubičastim (UV) zracima omogućava povećanje maksimalne rezolucije mikroskopa. Glavna prednost metode je da čestice mnogih supstanci, prozirne u vidljivoj svjetlosti, snažno apsorbiraju UV zračenje određenih valnih dužina i stoga se lako razlikuju na UV slikama. Mnoge tvari sadržane u biljnim i životinjskim stanicama (purinske baze, pirimidinske baze, većina vitamina, aromatične aminokiseline, neki lipidi, tiroksin itd.) imaju karakteristične apsorpcione spektre u UV području.
Pošto su ultraljubičaste zrake nevidljive ljudskom oku, slike u UV mikroskopiji se snimaju ili fotografski ili pomoću elektronsko-optičkog pretvarača ili fluorescentnog ekrana. Lijek se fotografiše u tri talasne dužine UV spektra. Svaki od rezultirajućih negativa je osvijetljen određenom bojom vidljive svjetlosti (na primjer, plava, zelena i crvena), i svi se istovremeno projektuju na jedan ekran. Rezultat je slika objekta u boji u konvencionalnim bojama, ovisno o kapacitetu apsorpcije lijeka u ultraljubičastom svjetlu.
Mikrofotografija i mikrokino- ovo je akvizicija slika na fotoosjetljivim slojevima pomoću mikroskopa. Ova metoda se široko koristi u kombinaciji sa svim drugim metodama mikroskopskog pregleda. Za mikrofotografiju i mikroskop potrebno je određeno restrukturiranje optičkog sistema mikroskopa – različito od vizuelnog posmatranja fokusiranja okulara u odnosu na sliku koju daje sočivo. Mikrofotografija je neophodna pri dokumentovanju istraživanja, kada se proučavaju objekti u UV i IR zracima nevidljivim oku (vidi gore), kao i objekti niskog intenziteta luminiscencije. Mikrofilmska fotografija je nezaobilazna u proučavanju procesa koji se odvijaju tokom vremena (vitalna aktivnost ćelija tkiva i mikroorganizama, rast kristala, pojava jednostavnih hemijskih reakcija, itd.).
Metoda interferentnog kontrasta
Metoda interferentnog kontrasta (interferentna mikroskopija) sastoji se od cijepanja svakog snopa pri ulasku u mikroskop. Jedna od rezultirajućih zraka usmjerena je kroz promatranu česticu, druga - pored nje duž iste ili dodatne optičke grane mikroskopa. U okularnom dijelu mikroskopa oba snopa su ponovo povezana i interferiraju jedan s drugim. Kondenzator i sočivo opremljeni su pločama s dvostrukim prelamanjem, od kojih prva dijeli izvorni svjetlosni snop na dva snopa, a druga ih ponovo spaja. Jedan od zraka, koji prolazi kroz objekat, kasni u fazi (prihvata razliku putanje u odnosu na drugu zraku). Veličina ovog kašnjenja se meri kompenzatorom. Ova metoda omogućava promatranje prozirnih i bezbojnih objekata, ali njihove slike mogu biti i višebojne (interferentne boje). Ova metoda je pogodna za proučavanje živih tkiva i ćelija i koristi se u mnogim slučajevima u tu svrhu. Metoda interferentnog kontrasta se često koristi u kombinaciji s drugim mikroskopskim metodama, posebno sa posmatranjem u polariziranom svjetlu. Njegova upotreba u kombinaciji sa ultraljubičastom mikroskopijom omogućava, na primjer, određivanje sadržaja nukleinskih kiselina u ukupnoj suhoj masi objekta.
Metoda istraživanja u luminescentnom svjetlu
Metoda studije u svjetlu luminiscencije sastoji se od promatranja pod mikroskopom zeleno-narandžastog sjaja mikro-objekata, koji nastaje kada su obasjani plavo-ljubičastim svjetlom ili ultraljubičastim zracima nevidljivim oku. U optičko kolo mikroskopa uvedena su dva svjetlosna filtera. Jedan od njih je postavljen ispred kondenzatora. On prenosi zračenje iz izvora iluminatora samo na onim talasnim dužinama koje pobuđuju luminescenciju bilo samog objekta (intrinzična luminiscencija) ili specijalnih boja koje se unose u preparat i apsorbuju od njegovih čestica (sekundarna luminiscencija). Drugi filter, koji se postavlja iza sočiva, prenosi samo luminescentno svjetlo do oka posmatrača (ili do fotoosjetljivog sloja). Fluorescentna mikroskopija koristi osvjetljavanje preparata kako odozgo (kroz sočivo, koje u ovom slučaju služi i kao kondenzator) tako i odozdo, kroz običan kondenzator. Metoda je našla široku primenu u mikrobiologiji, virologiji, histologiji, citologiji, u prehrambenoj industriji, u istraživanju tla, u mikrohemijskoj analizi i detekciji mana. Ova raznolikost primjena objašnjava se vrlo visokom osjetljivošću oka na boje i visokim kontrastom slike samosvjetlećeg objekta na tamnoj, neluminiscentnoj pozadini.
Metoda replike
Metoda replike se koristi za proučavanje površinske geometrijske strukture masivnih tijela. Sa površine takvog tijela uzima se otisak u obliku tankog filma ugljika, kolodija, formvara itd., koji ponavlja reljef površine i ispituje se u transmisijskom elektronskom mikroskopu. Obično, pod kliznim (malim prema površini) uglom, sloj teškog metala koji snažno raspršuje elektrone raspršuje se na repliku u vakuumu, zasjenjujući izbočine i udubljenja geometrijskog reljefa.
Način ukrašavanja
Metodom dekoracije ispituje se ne samo geometrijska struktura površina, već i mikropolja uzrokovana prisustvom dislokacija, nakupljanja točkastih defekata, faza rasta kristalnih lica, domenske strukture itd. Prema ovoj metodi, vrlo tanak sloj ukrasnih čestica (Au atomi) se prvo nanosi na površinu uzorka, Pt, itd., molekule poluvodiča ili dielektrika), deponuje uglavnom u područjima gdje su koncentrisana mikropolja, a zatim se uklanja replika sa inkluzijama ukrasnih čestica.
Za dobivanje ćelijskih frakcija široko se koriste različite vrste centrifugiranja: diferencijalno centrifugiranje, zonsko centrifugiranje i centrifugiranje s gradijentom ravnoteže gustoće. Teorijska i praktična pitanja vezana za centrifugiranje su opsežno razmotrena u Sykesovom pregledu.
Diferencijalno centrifugiranje
U slučaju diferencijalnog centrifugiranja, uzorci se centrifugiraju određeno vrijeme pri datoj brzini, nakon čega se supernatant uklanja. Ova metoda je korisna za odvajanje čestica koje uvelike variraju u brzinama sedimentacije. Na primjer, centrifugiranje u trajanju od 5-10 minuta na 3000-5000 d dovodi do sedimentacije intaktnih bakterijskih stanica, dok većina ćelijskih fragmenata ostaje u supernatantu. Fragmenti ćelijskog zida i velike membranske strukture mogu se peletirati centrifugiranjem na 20.000-50.000 § tokom 20 minuta, dok male membranske vezikule i ribozomi zahtevaju centrifugiranje na 200.000 § tokom 1 sata da bi se peletirali.
Zonsko centrifugiranje
Zonsko centrifugiranje je efikasna metoda za odvajanje struktura koje imaju sličnu gustinu plutanja, ali se razlikuju po obliku i masi čestica. Primjeri uključuju razdvajanje ribosomskih podjedinica, različite klase polisoma i molekule DNK različitih oblika. Centrifugiranje se vrši ili u bucket rotorima ili u posebno dizajniranim zonskim rotorima; Da bi se sprečila konvekcija tokom centrifugiranja, stvara se slab gradijent (obično saharoza) u čašama rotora sa kašikom ili u komori zonskog rotora. Uzorak se nanosi u obliku zone ili uske trake na samom vrhu stupca gradijenta. Za subcelularne čestice, obično se koristi gradijent saharoze od 15 do 40% (w/v).
Laue metoda
koristi se za monokristale. Uzorak je ozračen snopom kontinuiranog spektra, pri čemu se međusobna orijentacija zraka i kristala ne mijenja. Ugaona raspodjela difraktiranog zračenja ima oblik pojedinačnih difrakcijskih mrlja (Lauegram).
Debye-Scherrerova metoda
Koristi se za proučavanje polikristala i njihovih mješavina. Nasumična orijentacija kristala u uzorku u odnosu na upadni monohromatski snop pretvara difraktirane zrake u familiju koaksijalnih čunjeva sa upadnim snopom na osi. Njihova slika na fotografskom filmu (debyegram) ima oblik koncentričnih prstenova, čija lokacija i intenzitet nam omogućavaju da prosudimo sastav supstance koja se proučava.
Metoda ćelijske kulture
Neka tkiva se mogu podijeliti na pojedinačne ćelije tako da ćelije ostaju žive i često se mogu razmnožavati. Ova činjenica definitivno potvrđuje ideju o ćeliji kao životnoj jedinici. Sunđer, primitivni višećelijski organizam, može se razdvojiti na ćelije trljanjem kroz sito. Nakon nekog vremena, ove ćelije se ponovo povezuju i formiraju spužvu. Embrionalna tkiva životinja mogu se natjerati da se razdvoje pomoću enzima ili drugih sredstava koja slabe veze između stanica.
Američki embriolog R. Garrison (1879-1959) bio je prvi koji je pokazao da embrionalne, pa čak i neke zrele ćelije mogu rasti i razmnožavati se izvan tijela u prikladnom okruženju. Ovu tehniku, nazvanu kultivisanje ćelija, usavršio je francuski biolog A. Carrel (1873-1959). Biljne ćelije se takođe mogu uzgajati u kulturi, ali u poređenju sa životinjskim ćelijama one formiraju veće nakupine i čvršće su vezane jedna za drugu, tako da se tkiva formiraju kako kultura raste, a ne pojedinačne ćelije. U kulturi ćelija, cijela odrasla biljka, kao što je šargarepa, može se uzgajati iz jedne ćelije.
Metoda mikrofigura
Koristeći mikromanipulator, pojedinačni dijelovi ćelije mogu se ukloniti, dodati ili na neki način modificirati. Velika ćelija amebe može se podijeliti na tri glavne komponente - ćelijsku membranu, citoplazmu i jezgro, a zatim se te komponente mogu ponovo sastaviti i formirati živu ćeliju. Na taj način se mogu dobiti umjetne ćelije koje se sastoje od komponenti različitih vrsta ameba.
Ako uzmemo u obzir da je moguće umjetno sintetizirati neke ćelijske komponente, onda bi eksperimenti u sklapanju umjetnih stanica mogli biti prvi korak ka stvaranju novih oblika života u laboratoriju. Budući da se svaki organizam razvija iz jedne ćelije, metoda proizvodnje umjetnih stanica u principu omogućava izgradnju organizama date vrste, ako se istovremeno koriste komponente koje se neznatno razlikuju od onih koje se nalaze u postojećim stanicama. U stvarnosti, međutim, nije potrebna potpuna sinteza svih ćelijskih komponenti. Strukturu većine, ako ne i svih, komponenti ćelije određuju nukleinske kiseline. Dakle, problem stvaranja novih organizama svodi se na sintezu novih vrsta nukleinskih kiselina i njihovu zamjenu prirodnim nukleinskim kiselinama u određenim stanicama.
Metoda ćelijske fuzije
Druga vrsta umjetnih stanica može se dobiti spajanjem stanica iste ili različitih vrsta. Da bi se postigla fuzija, ćelije su izložene virusnim enzimima; u ovom slučaju, vanjske površine dvije ćelije su zalijepljene zajedno, a membrana između njih je uništena i formira se ćelija u kojoj su dva seta hromozoma zatvorena u jednom jezgru. Moguće je spajanje ćelija različitih tipova ili u različitim fazama diobe. Ovom metodom bilo je moguće dobiti hibridne ćelije miša i piletine, čovjeka i miša te čovjeka i žabe. Takve ćelije su hibridne samo u početku, a nakon brojnih dioba stanica gube većinu hromozoma jednog ili drugog tipa. Konačni proizvod postaje, na primjer, u suštini mišja ćelija bez prisutnih ljudskih gena ili ih ima samo u tragovima. Posebno je zanimljiva fuzija normalnih i malignih ćelija. U nekim slučajevima hibridi postaju maligni, u drugima ne, tj. oba svojstva mogu se manifestovati i kao dominantna i kao recesivna. Ovaj rezultat nije neočekivan, jer malignitet može biti uzrokovan raznim faktorima i ima složen mehanizam.
svjetlo ćelijske mikroskopije
Aneks 1
Slika 2. Kriotom Slika 3. Fazni kontrastni mikroskop
Slika 4. Interferentni mikroskop
Objavljeno na Allbest.ru
...Slični dokumenti
Proučavanje strukture i principa rada svjetlosnih i elektronskih mikroskopa. Razmatranje tehnika tamnog i svijetlog polja, faznokontrastna mikroskopija, interferencija i polarizacija. Studija vitalnih fiksnih ćelija. Osnove elektronske mikroskopije.
predavanje, dodato 16.05.2014
Skenirajući tunelski mikroskop, primjena. Princip rada mikroskopa atomske sile. Proučavanje bioloških objekata - makromolekula (uključujući molekule DNK), virusa i drugih bioloških struktura pomoću mikroskopije atomske sile.
kurs, dodan 28.04.2014
Koncept elektronske mikroskopije kao skup metoda za proučavanje mikrostrukture tijela i njihovog lokalnog sastava pomoću elektronskih mikroskopa. Sadržaj televizijskog principa skeniranja tankog snopa elektrona ili jona preko površine uzorka.
prezentacija, dodano 22.08.2015
Mjerenje veličine malih predmeta. Metoda faznog kontrasta. Koncept elektronske optike. Stvaranje elektronskog mikroskopa. Eksperimenti na difrakciji elektrona. Istraživanje površinske geometrijske strukture ćelija, virusa i drugih mikroobjekata.
prezentacija, dodano 12.05.2017
Metoda elektronsko mikroskopskog istraživanja. Fizičke osnove skenirajuće elektronske mikroskopije. Shema skenirajućeg elektronskog mikroskopa, namjena njegovih komponenti i njihovo funkcioniranje. Priprema objekata za istraživanje i posebni zahtjevi za njih.
kurs, dodan 04.05.2011
Optički spektar. Teorijske osnove optičkih NDT metoda. Lagane vibracije. Klasifikacija optičkih NDT metoda. Diskretni emisioni spektar gasova i tečnosti. Kontinuirani spektar intrinzičnog zračenja čvrstih tijela s različitim temperaturama.
sažetak, dodan 15.01.2009
Opšte karakteristike metoda koje se koriste za mjerenje parametara kapilara matrica: holografska interferometrija, Fourierova optika, mikroskopska. Komparativna analiza razmatranih metoda, utvrđivanje njihovih glavnih prednosti i nedostataka.
test, dodano 20.05.2013
Izrada atomsko-silnog mikroskopa, princip rada, prednosti i nedostaci. Metode mikroskopije atomske sile. Tehničke mogućnosti atomsko-silnog mikroskopa. Primjena mikroskopije atomske sile za opisivanje deformacija polimernih filmova.
kurs, dodan 14.11.2012
Istorija mikroskopa - uređaja za dobijanje uvećanih slika objekata nevidljivih golim okom. Metode svjetlosne mikroskopije. Princip rada i struktura metalografskog mikroskopa. Metode za mikroskopsko ispitivanje metala.
sažetak, dodan 06.10.2009
Osnove skenirajuće elektronske mikroskopije. Metodološke karakteristike elektronskog mikroskopskog ispitivanja taline metala. Značajke mikroskopa dizajniranih za proučavanje strukture površinskih slojeva metalnih talina.
E. Mikroskopija tamnog polja.
18. Mikroskop se sastoji od optičkog i mehaničkog dijela. Šta su optički dijelovi?
A. Cijev, okular, kondenzator
B. Revolver, makro i mikrošraf, ogledalo
C. Revolver, okular
D. Okular, kondenzator, objektiv
E. Cijev, okular, revolver
19. Kada koristite ultraljubičaste zrake kao izvor svjetlosti, rezolucija mikroskopa se povećava. Koji mikroskopski uređaji koriste ovaj izvor svjetlosti?
A. Tamno polje i luminiscentno
B. Luminescentno, ultraljubičasto
S. Lagani i elektronski
D.Fazni kontrast, ultraljubičasto
E. Polarizirajuće, ultraljubičasto
20. Mikroskop se sastoji od mehaničkog i optičkog dijela. Koji dijelovi mikroskopa imaju dijafragmu?
A. Okular i objektiv
B. Okular i kondenzator
C. Cev i okular
D. Objektiv i kondenzator
E. Cijev, sočivo, okular
21. U eksperimentu su korišćeni živi objekti u kojima je potrebno vitalnim posmatranjem odrediti određeni broj hemijskih komponenti. Koja će se metoda mikroskopskog pregleda koristiti?
A. Mikroskopija faznog kontrasta
B. Elektronska mikroskopija
C. Fluorescentna mikroskopija
E Mikroskopija tamnog polja.
22. Za histološko ispitivanje ćelija korišteni su fosfori. Koja vrsta mikroskopije je korištena u ovom slučaju?
A. Svetlosna mikroskopija
B. Elektronska mikroskopija
C. Fluorescentna mikroskopija
D. Polarizaciona mikroskopija
E. Mikroskopija tamnog polja.
23. Istraživač ima zadatak da dobije prostorno razumijevanje struktura objekta koji se proučava. S kojim mikroskopskim instrumentom će specijalist raditi?
A. Ultraljubičasta mikroskopija,
B. Mikroskopija faznog kontrasta,
C. Transmisiona elektronska mikroskopija,
D. Skenirajuća elektronska mikroskopija,
E. Polarizaciona mikroskopija
24. Kao izvor svjetlosti koriste se živino-kvarcne lampe. Koja je rezolucija mikroskopa s ovim izvorom svjetlosti?
25. Rezolucija mikroskopa zavisi od talasne dužine izvora svetlosti. Koja je moć razlučivanja svjetlosnog mikroskopa?
26. Prije početka pregleda histološkog preparata potrebno je jednoliko osvijetliti vidno polje. Koji se dijelovi mikroskopa koriste za to?
A. Mikro- i makrovit
B. Kondenzator i ogledalo
C. Cijev i držač cijevi
D. Cijev i okular
27. Istraživač je bio zadužen za proučavanje ultramikroskopske strukture plazmaleme eritrocita. Koji će se mikroskopski instrument koristiti?
A. Svetova
B. Fazni kontrast
C. Electronic
D. Polarizacija
E. Ultraljubičasto
28. Prilikom proučavanja skeletnog mišićnog tkiva potrebno je odrediti izo- i anizotropne strukture tkiva. Koja vrsta mikroskopije će se koristiti?
A. Svetova
B. Fazni kontrast
C. Electronic
D. Polarizacija
E. Ultramikroskopski
29. Rezolucija fluorescentnog mikroskopa zavisi od talasne dužine izvora svetlosti. Čemu je to jednako?
A. 0,1 µm C. 0,4 µm
B. 0,2 µm D. 0,1 nm
30. U kliničkoj laboratoriji mikroskopski pregledi se koriste za proučavanje kompletne krvne slike. Koji je mikroskop potreban za ovo?
A. Svetovoy,
B. Fazni kontrast,
S. Electronic,
D. Polarizacija,
E. Ultraljubičasto.
31. Za istraživanje je predstavljen živi objekat sa prirodnom luminiscencijom. Koju vrstu mikroskopije treba koristiti za ovu studiju?
A. Svetova
B. Fazni kontrast
C. Electronic
D. Polarizacija
E. Ultraljubičasto
32. Kao rezultat biopsije, dobijen je materijal tumorskih ćelija. Potrebno je proučiti njihovu ultramikroskopsku strukturu. Koja vrsta mikroskopije se koristi u ovoj studiji?
A. Svetova
B. Fazni kontrast
C. Electronic
D. Polarizacija
E. Ultraljubičasto
TEMA 2: HISTOLOŠKA TEHNIKA
Osnovni principi pripreme preparata za svetlosnu i elektronsku mikroskopiju, uzimanje materijala (biopsija, biopsija punkcijom iglom, obdukcija). Fiksacija, dehidracija, zbijanje objekata, priprema preseka na mikrotomima i ultramikrotomima. Vrste mikropreparata - presek, bris, otisak, film, tanki presek. Preparati za bojenje i kontrast. Koncept histoloških boja.
Mikroskopska tehnika.
Glavne faze citološke i histološke analize:
Odabir objekta istraživanja
Priprema za pregled pod mikroskopom
Primjena mikroskopskih metoda
Kvalitativna i kvantitativna analiza dobijenih slika
Metode koje se koriste u histološkoj tehnologiji:
1. Životni vijek.
2. Posthumno.
I INTERVITUALNE METODE
Svrha intravitalnog istraživanja je da se dobiju informacije o životu ćelije: kretanje, deoba, rast, diferencijacija, interakcija ćelija, očekivani životni vek, destrukcija, reaktivne promene pod uticajem različitih faktora.
Proučavanje živih ćelija i tkiva moguće je izvan tijela (in vitro) ili unutar tijela (in vivo).
A. Proučavanje živih ćelija i tkiva u kulturi (in vitro) –
Način uzgoja
Postoje: a) suspenzijske kulture (ćelije suspendovane u hranljivoj podlozi), b) tkivo, c) organ, d) jednoslojni.
Metoda uzgoja tkiva izvan tijela je najčešća. Tkivo se može uzgajati u posebnim prozirnim hermetički zatvorenim komorama. U sterilnim uslovima, kap hranljivog medijuma se stavlja u komoru. Najbolji hranljivi medij je krvna plazma u koju se dodaje embrionalni ekstrakt (ekstrakt iz tkiva embrija koji sadrži veliku količinu tvari koje stimuliraju rast). Tu se stavlja i komad organa ili tkiva (ne više od 1 mm3) koji treba uzgajati.
Uzgojno tkivo treba održavati na tjelesnoj temperaturi organizma čije je tkivo uzeto za istraživanje. Budući da hranjivi medij brzo postaje neupotrebljiv (u njemu se nakupljaju proizvodi razgradnje koje oslobađa kultivirano tkivo), potrebno ga je mijenjati svakih 3-5 dana.
Korištenje metode uzgoja omogućilo je identifikaciju niza obrazaca diferencijacije, maligne degeneracije stanica, interakcija stanica među sobom, kao i sa virusima i mikrobima. Kultivacija embrionalnih tkiva omogućila je proučavanje razvoja kostiju, hrskavice, kože itd.
Metoda uzgoja je od posebnog značaja za provođenje eksperimentalnih opservacija na ljudskim stanicama i tkivima, posebno za određivanje spola, maligne degeneracije, nasljednih bolesti itd.
Nedostaci metode:
1. Glavni nedostatak ove metode je to što se tkivo ili organ ispituje izolovano od tijela. Ne iskusivši neurohumoralni utjecaj tijela, ono gubi svoju inherentnu diferencijaciju.
2. Potreba za čestim transplantacijama (sa dugotrajnim uzgojem).
3. Identični indeks prelamanja tkiva.
Povezane informacije.
Polarizaciona mikroskopija- jedna od veoma efikasnih metoda morfološkog istraživanja, koja ima široke mogućnosti za identifikaciju bioloških struktura, što u kombinaciji sa dostupnošću i relativnom jednostavnošću određuje njegovu visoku vrednost. Metoda omogućava proučavanje ne samo histološke strukture lijeka, već i nekih njegovih histokemijskih parametara. 40-ih i 50-ih godina XX vijeka. polarizaciona mikroskopija se smatrala ultrastrukturnom metodom, jer je omogućila uvid u ultrastrukturne sposobnosti tkiva.
Polarizaciona mikroskopija je dizajnirana za proučavanje svojstava histoloških struktura koje imaju sposobnost dvostrukog prelamanja (anizotropije) - cijepanja svjetlosnog snopa pri prolasku kroz anizotropni medij. Svjetlosni val u anizotropnom mediju raspada se na dva talasa sa međusobno okomitim ravnima oscilovanja elektromagnetnih talasa. Ove ravni se nazivaju ravnima polarizacije. Polarizovana svetlost se razlikuje od obične (nepolarizovane) svetlosti po tome što kod potonje svetlosni talasi osciluju u različitim ravnima, dok se u polarizovanoj svetlosti javljaju samo u određenoj ravni.
Za stvaranje efekta polarizacije, polarizacijski mikroskop koristi dva polaroida. Prvi, koji se naziva polarizator, nalazi se između iluminatora mikroskopa i histološkog uzorka, a drugi polaroid, koji se nalazi između histološkog uzorka i oka istraživača, je analizator. I polarizator i analizator su optički potpuno isti polarizacijski filteri, tako da se mogu zamijeniti (ako dizajn mikroskopa to dozvoljava). Ranije su se za polarizacionu mikroskopiju koristile Nicolas, Arens ili Thomsonove prizme napravljene od islandskog šparta. Ove prizme su imale ograničen ugao prelamanja svetlosti. Trenutno se umjesto njih koriste ravni polarizacijski filteri koji proizvode polariziranu svjetlost širokog polja.
U stvaranju polarizirane svjetlosti, odlučujuću ulogu ima relativni položaj polarizatora i analizatora u odnosu na optičku os mikroskopa. Ako su orijentisani tako da oba prenose polarizovanu svetlost u istoj ravni, tj. kada se njihove ravni polarizacije poklapaju, oba polarizujuća filtera su sposobna da prenose polarizovanu svetlost; vidno polje mikroskopa je svetlo (slika 1a).
Rice. 1 Brightfield uzorak ljudskog pluća, OlympusCX41, 10x sočivo
Ako su ravni polarizacije polarizacijskih filtara međusobno okomite (to se postiže rotacijom analizatora za 90° oko optičke ose mikroskopa), tada polarizirana svjetlost ne prolazi i istraživač vidi tamno vidno polje (sl. 2).
Kada se polarizator okrene za 360° dok se okreće, vidno polje je dva puta potpuno zatamnjeno i dvaput potpuno svjetlije. U prošlosti su se koristili kompenzacijski Bernauer filteri, koji proizvode crvenkastu nijansu tamnog vidnog polja ( U-TP530 ). Kada se koriste crni zrcalni filteri, zatamnjeno vidno polje ne izgleda potpuno tamno, već slabo osvijetljeno.
Slika 2 Uzorak ljudskih pluća u polarizovanom svetlu, 10x objektiv
U slučajevima kada se kod ukrštenog položaja polarizacionih filtera (tj. u ortoskopiji) na putu polarizovane svetlosti nađu anizotropne supstance sadržane u histološkom uzorku, te supstance dele polarizovanu svetlost na dva snopa sa međusobno okomitim ravnima oscilovanja svetlosti. talasi. Svjetlosni zraci čija se ravnina vibracije poklapa s ravninom polarizacije prolaze kroz analizator, a one s ravninom okomitom se odsječu, zbog čega je intenzitet svjetlosnog toka koji ulazi u oko istraživača i na kameru je samo polovina. intenzitet originalnog svetlosnog snopa. Kao rezultat opisanih procesa, anizotropne tvari smještene između dva ukrštena polarizatora vidljive su na tamnoj pozadini u obliku svijetlih svjetlećih objekata. Istovremeno, izotropne strukture koje nemaju sposobnost dvostrukog prelamanja ostaju tamne.
Ovo takođe utiče na izbor kamere za polarizacionu mikroskopiju. Budući da je zadatak uhvatiti male svijetle signale na tamnoj pozadini, obično kamera za mikroskopiju svijetlog polja možda neće biti dovoljna zbog niske osjetljivosti kamere i velike količine šuma koja se stvara tokom snimanja. Za polarizacionu mikroskopiju Potrebna je mikroskopska kamera sa visokom osjetljivošću i preciznom reprodukcijom boja. Poželjno je koristiti kamere zasnovane na CCD matricama (, VZ-CC50S), međutim, u trenutnoj fazi, možete koristiti i budžetske verzije kamera zasnovanih na CMOS matricama Sony IMX serije ().
Biološka tkiva sadrže dovoljan broj anizotropnih struktura: elemente kontraktilnog aparata mišića, amiloid, mokraćnu kiselinu, kolagenske formacije, neke lipide, određeni broj kristala itd.
Svjetlosne zrake koje se cijepaju u anizotropnom objektu i prolaze kroz analizator karakteriziraju nejednake brzine širenja valova. U zavisnosti od veličine ove razlike (također se naziva vrijednost kašnjenja svjetlosnog snopa) i zbog razlika u apsorpciji svjetlosti u analizatoru, sjaj anizotropnih objekata može biti bijeli ili obojen. U potonjem slučaju govorimo o fenomenu dihroizma ( dvostruka apsorpcija I). Kada se proučavaju u polariziranom polju, efekti boja proizvode se, na primjer, od strane mnogih kristala.
Proces dvostrukog prelamanja može se poboljšati upotrebom određenih boja, čiji molekuli imaju sposobnost da se orijentirano talože na anizotropne strukture. Histohemijske reakcije koje rezultiraju efektom anizotropije nazivaju se topo-optičke reakcije (G. Romhanyi). Postoje dvije vrste takvih reakcija - aditivna i inverzna. Kod aditivnih reakcija povećava se kašnjenje svjetlosnog snopa, što se naziva pozitivna anizotropija, a kod inverznih reakcija se smanjuje - negativna anizotropija.
HARDVER I OPREMA
Polarizaciona mikroskopija se izvodi pomoću posebnih polarizacionih mikroskopa. Kao primjer možemo navesti uvozne mikroskope. Većina modernih optičkih mikroskopa opremljena je priborom za polarizacionu mikroskopiju.
Bilo koji laboratorijski ili istraživački svjetlosni mikroskop može se koristiti za polarizacionu mikroskopiju. Dovoljno je imati dva polarizirajuća filtera, od kojih je jedan, kao polarizator, postavljen između izvora svjetlosti i uzorka, a drugi, koji ima ulogu analizatora, postavljen između uzorka i oka istraživača. Polarizator se može ugraditi u kondenzator ili postaviti ispod njega iznad dijafragme polja, a analizator se može postaviti u prorez na revolveru ili u međuuložak.
Na sl. Slika 3 prikazuje šematski dijagram polarizacionog mikroskopa. Pored komponenti zajedničkih za sve svjetlosne mikroskope, polarizacijski mikroskop ima dva polarizirajuća filtera (polarizator koji se obično nalazi ispod kondenzatora i analizator smješten u okularu), kao i kompenzator. Analizator se mora rotirati, a za određivanje stepena rotacije potrebna je odgovarajuća graduirana skala.
Polarizacijski mikroskop koristi izvor osvjetljenja koji pruža veliku gustinu svjetlosnog snopa. Kao takav izvor preporučuje se upotreba lampe od 100 W na naponu od 12 V. Za neke vrste istraživanja potrebno je monohromatsko svjetlo. U tu svrhu koristi se metalni filter za smetnje, koji je najbolje postaviti iznad ogledala. Matirano staklo koje raspršuje svjetlost se postavlja ispred polarizatora, tj. između njega i izvora svjetlosti, ali ni u kom slučaju nakon polarizatora, jer će to poremetiti funkciju polarizacijskog filtera.
U prošlosti su se za polarizacionu mikroskopiju koristili akromatski objektivi bez unutrašnje napetosti, ali su danas rijetki. Danas se u polarizirajućim mikroskopima koriste samo planski akromatski objektivi koji nemaju unutrašnje napetosti. Apohromatska sočiva se mogu koristiti samo u slučajevima kada je potreban normalan prikaz boja tokom mikrofotografije.
Polarizacijski mikroskopi su opremljeni rotirajućim stupnjem, čiji se položaj u odnosu na optičku os može mijenjati. Ugao rotacije stola se mjeri pomoću stepena skale označene duž njegovog obima. Jedan od preduslova za efikasnu upotrebu polarizacione mikroskopije je pažljivo poravnavanje rotirajućeg stepena pomoću šrafova za centriranje.
Važan element polarizacionog mikroskopa je kompenzator postavljen između objektiva i analizatora, obično u cijevi mikroskopa. Kompenzator je ploča izrađena od posebnih vrsta gipsa, kvarca ili liskuna. Omogućava vam da izmjerite razliku u putanji podijeljenih svjetlosnih zraka, izraženu u nanometrima. Funkcioniranje kompenzatora osigurava se njegovom sposobnošću da promijeni razliku u putanji svjetlosnih zraka, smanjivši je na nulu ili povećavši je do maksimuma. To se postiže rotacijom kompenzatora oko optičke ose.
MIKROSKOPSKA TEHNIKA U POLARIZOVANOM SVETLU
Prikladnije je provoditi polarizacijsku mikroskopiju u zamračenoj prostoriji, jer je intenzitet svjetlosnog toka koji ulazi u oko istraživača smanjen za 2 puta u odnosu na originalni. Nakon uključivanja iluminatora mikroskopa, prvo ostvarite najsjajnije moguće osvjetljenje vidnog polja rotacijom polarizatora ili analizatora. Ova pozicija polarizacionih filtera odgovara podudarnosti njihovih ravni polarizacije. Lijek se postavlja na pozornicu i prvo proučava u svijetlom polju. Zatim se rotacijom polarizatora (ili analizatora) vidno polje zatamni što je više moguće; ovaj položaj filtera odgovara okomitom rasporedu ravni polarizacije. Da bi se otkrio efekat anizotropije, potrebno je kombinovati ravan polarizacije anizotropnog objekta sa ravninom polarizovane svetlosti. Empirijski, ovo se postiže rotiranjem stepena objekta oko optičke ose. Ako se za polarizacionu mikroskopiju koristi svjetlosni mikroskop koji nije opremljen rotirajućim stupnjem, tada se histološki uzorak mora ručno rotirati. Ovo je prihvatljivo, ali je u ovom slučaju nemoguće izvršiti određene vrste polarizacione mikroskopije koje zahtijevaju kvantitativnu procjenu (određivanje predznaka dvoloma, veličine razlike u putanji svjetlosnih zraka).
Ako su anizotropni objekti u uzorku raspoređeni na uredan način (na primjer, anizotropni diskovi prugastih mišićnih vlakana), zgodno ih je proučavati u fiksnoj poziciji pozornice, u kojoj ti objekti daju maksimalnu luminescenciju na tamnoj pozadini. . Ako se anizotropne strukture nalaze kaotično u preparatu (na primjer, kristali), onda kada ih proučavate, morate stalno rotirati pozornicu kako biste postigli sjaj jedne ili druge grupe objekata.
Za dublju analizu i evaluaciju topooptičkih reakcija potrebno je poznavati metodologiju za određivanje relativnog predznaka dvoloma, veličine razlike putanje zraka i indeksa (koeficijenta) refrakcija.
Znak dvolomnosti karakteriše stepen i pravac pomeranja putanje svetlosnih zraka koje prolaze kroz analizator. Ovaj pomak uzrokovan je topooptičkim bojama, a ako je usmjeren na smanjenje razlike u putanji zraka, one govore o negativnom predznaku dvolomnosti ( negativna anizotropija), ako pomaže da se poveća razlika u putanji zraka, tada se navodi pozitivan znak dvoloma ( pozitivna anizotropija). Ako razlika u putanji zraka nestane, onda se efekat anizotropije izravnava.
Znak dvoloma se određuje pomoću kompenzatora. Procedura za njegovu upotrebu je sljedeća. Objekat koji se proučava postavlja se u poziciju u kojoj se postiže maksimalna luminiscencija anizotropnih struktura u tamnom vidnom polju. RI kompenzatorska ploča se rotira oko optičke ose pod uglom od +45° u odnosu na ravan polarizacije analizatora. Objekt, ovisno o razlici u putanji svjetlosnih zraka, koja može biti u rasponu od 20 do 200 nm, poprima ili plavu ili žutu boju. U prvom slučaju, znak dvolomnosti je pozitivan, u drugom - negativan. Treba imati na umu da u slučaju kada se kompenzator nalazi pod kutom od +45°, ukupna pozadina zatamnjenog vidnog polja ima crvenu nijansu.
Može se koristiti i λ/4 kompenzator (U-TP137). Postupak korištenja je isti, samo vidno polje ima sivu nijansu, a ne crvenu, a objekt svijetli pozitivnim predznakom prelamanja, a zatamnjen je negativnim predznakom.
Kvantitativno određivanje razlike u putanji svjetlosnih zraka, izraženo u nanometrima, vrši se pomoću Braque Köhler kompenzatora. Da biste to učinili, koristite formulu:
Γ=Γλ×sinφ
gdje je λ konstanta koju je proizvođač označio na kompenzatoru, φ je ugao rotacije kompenzatora u odnosu na ravan polarizacije analizatora.
Indeks prelamanja anizotropnog objekta određuje se poređenjem (pod mikroskopom) sa testnim objektom koji se nalazi pored njega. Kao ispitni objekti koriste se standardne tekućine sa poznatim indeksom prelamanja. Predmet i uzorak se postavljaju jedan pored drugog na pozornicu. Kada im se indeksi loma ne podudaraju, između objekta i uzorka vidljiva je svjetlosna linija koja se zove Beckova linija. Podizanje cijevi mikroskopa u odnosu na fokusnu poziciju uzrokuje pomak Bekove linije prema mediju, što daje izraženiji efekat refrakcije. Kada se indeksi loma objekta i uzorka poklope, Bekova linija nestaje. Tipično, indeks loma se određuje u monokromatskom svjetlu za natrijevu liniju spektra (na valnoj dužini od 589 nm i temperaturi od 20 °C). Refrakciju treba odrediti za dvije međusobno okomite ravni polarizacije. U tu svrhu se uklanja analizator i snima se prelamanje objekta u njegova dva međusobno okomita položaja. Razlika između oba indeksa prelamanja (ng - nk) karakteriše jačinu prelamanja.
OSOBINE OBRADE MATERIJALA I PRIPREME PREPARATA
Fiksni materijal za polarizacionu mikroskopiju u kiselom formalinu je nepoželjan, jer formalinski pigment nastao interakcijom tkivnog hemoglobina sa kiselim formaldehidom ima anizotropna svojstva i otežava proučavanje preparata u polarizovanom svetlu. G. Scheuner i J. Hutschenreiter (1972) preporučuju upotrebu 10% neutralnog formalina, Bakerovog rastvora kalcijum-formola i Carnoyeve tečnosti za ovu svrhu.
Trajanje fiksacije u 10% neutralnom formalinu je 24 - 72 sata na 4 °C, u Bakerovoj otopini kalcijum-formola - 16 - 24 sata na 4 °C. Fiksacija u kalcijum-formolu je posebno poželjna kada se proučavaju jedinjenja lipida i proteina. Carnoyeva tečnost brzo zasićuje tkanine. Komadi debljine 1 - 2 mm mogu se profilisati nakon samo 1 sat na temperaturi od 4 °C. Fiksacija u Carnoyevoj tečnosti nije pogodna za studije lipida. Osim toga, koristi se Zenkerova tekućina, posebno kada je impregnirana solima zlata i srebra. Nakon tretmana mješavinom Zenkerove tekućine i octene kiseline, crvena krvna zrnca stiču sposobnost da se podvrgnu dvolomu.
Prilikom ispitivanja gustih tkiva (kosti, zuba) u polarizirajućem mikroskopu, osim kiselog dekalcifikacije, potrebna je i dodatna obrada za uklanjanje kolagenih vlakana. U tu svrhu, delovi takvih tkiva se kuvaju nekoliko minuta u mešavini glicerina i kalijum hidroksida (10 ml glicerina i 2 zrna kalijum hidroksida) dok potpuno ne pobele, zatim se lužina pažljivo ocedi, presek se ispere u vodi. i prebačen pincetom u fazu mikroskopa.
Za polarizacionu mikroskopiju koriste se parafinski, smrznuti i kriostatski preseci. Neobojeni zamrznuti delovi za pregled pod polarizovanim svetlom su ugrađeni u glicerol. Nefiksirane kriostatske sekcije su pogodne za polarizacionu mikroskopsku analizu odmah nakon pripreme. Zbog njihove visoke osjetljivosti na štetno djelovanje različitih faktora okoline, ove se preseke i dalje preporučuje fiksirati u 10% neutralnom rastvoru formaldehida ili kalcijum-formola.
Na rezultate polarizacione mikroskopije utiče debljina histoloških preseka. Pri proučavanju debelih presjeka stvaraju se uvjeti za superpoziciju različitih anizotropnih struktura jedna na drugu. Osim toga, s različitim debljinama rezova, anizotropna svojstva struktura koje se proučavaju mogu se promijeniti, pa je vrlo važno, posebno u komparativnim studijama, osigurati konstantnu debljinu kriške. Preporučena maksimalna debljina presjeka ne smije prelaziti 10 µm.
Drugi obavezan uslov je pažljivo deparafinisanje preseka, jer neuklonjeni ostaci parafina daju izražen efekat anizotropije, što otežava studiju. Parafin se posebno dugo zadržava na crvenim krvnim zrncima i jezgrima ćelija. Kako bi se u potpunosti uklonio parafin iz sekcija, preporučuje se da se izvrši sljedeća obrada.
- Ksilen 30 min
- Alkohol 100% 5 min
- Mešavina metanola i hloroforma (1:1) na 50 °C tokom 24 sata
- Alkohol 100% 5 min
- Alkohol 70% 10 min Voda
Takođe treba imati na umu da preseci koji su podvrgnuti polarizacionoj mikroskopiji ne bi trebalo da dolaze u kontakt sa fenolima (na primer, ne bi trebalo da se čiste u karbonskom ksilenu).
Detaljnije informacije o polarizacionoj mikroskopiji i upotrebi kompenzatora mogu se dobiti na linku (http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/polarized/polarizedhome.html).
Ako imate bilo kakvih pitanja o polarizacionoj mikroskopiji, obratite se Školi za mikroskopiju.
Od svih raznih uređaja za mikroskopiju, polarizacijski mikroskopi su tehnički najsloženiji. Takva pažnja prema dizajnu uređaja u pogledu tehnološkosti proizlazi iz potrebe da se dobiju slike najvišeg kvaliteta, na koje direktno utiče dizajn optičkog i svjetlosnog dijela mikroskopa. Glavna oblast upotrebe polarizacionih uređaja za mikroskopiju je proučavanje minerala, kristala, troske, anizotropnih objekata, tekstila i vatrostalnih proizvoda, kao i drugih materijala koji se odlikuju dvolomom. Potonji princip se koristi za formiranje slika u mikroskopskim uređajima u kojima je uzorak koji se proučava zračen polarizacijskim zracima. U ovom slučaju, anizotropna svojstva uzoraka se pojavljuju nakon promjene smjera zraka. Za ove svrhe, dizajn polarizacionih mikroskopa uključuje filtere polja koji se rotiraju u različitim ravninama jedan u odnosu na drugi: analizator se rotira za 180 stepeni, a polarizator se rotira za 360. Glavna karakteristika uređaja za mikroskopiju u polarizovanom svetlu je sposobnost provođenja ortoskopskih i konoskopske studije, koje nisu dostupne kod većine drugih vrsta mikroskopa.
Proučavanje uzorka pod polarizacijskim mikroskopom počinje ugradnjom polarizatora u dio za osvjetljavanje mikroskopa ispod kondenzatora, pored otvora dijafragme. U ovom slučaju, analizator se nalazi između okulara i sočiva - iza potonjeg duž putanje svjetlosnih zraka. Uz ispravnu postavku takvog uređaja za mikroskopiju, nakon prelaska filterskih polja, vidljivo polje će biti jednolično tamno, formirajući takozvani efekat ekstinkcije. Po završetku podešavanja uređaja, uzorak koji se proučava se fiksira na binu i proučava. Stolovi polarizacionih mikroskopa su centrirani u odnosu na optičku osu i mogu se rotirati za 360 stepeni, a kod sličnih uređaja za laboratorijske i istraživačke svrhe imaju i nonius. Optika i sistem osvetljenja polarizacionih mikroskopa su najvišeg kvaliteta i takve preciznosti izrade koja omogućava da se dobije što jasnija slika bez izobličenja. Često skup uređaja za proučavanje uzoraka u polariziranom svjetlu uključuje kompenzator i Bertrandov objektiv. Prvi omogućava efikasno proučavanje strukture minerala, a sočivo vam omogućava da povećate i fokusirate područje posmatranja kada dođe do promjena slike nakon rotiranja pozornice. Danas na tržištu postoje tri glavna tipa ovakvih uređaja za mikroskopiju - već spomenuti istraživački i laboratorijski mikroskopi, kao i radni polarizacijski mikroskop.