Preparativ sentrifugalash uchun sentrifugalarning xususiyatlari. Ma'ruza: Santrifugalash Santrifugalash usuli aniqlash imkonini beradi
Turli o'lchamdagi zarrachalardan tashkil topgan aralashmani bir hil bo'lgan fraktsiyalarga ajratish zarurati ko'p sohalarda mavjud. Vazifani engishning eng samarali, oddiy va arzon usullaridan biri bu santrifüjdir. Qoida tariqasida, uni amalga oshirish uchun maxsus apparatlar, laboratoriya shisha idishlari, shuningdek, quritish shkaflari kabi yordamchi uskunalar kerak bo'ladi.
Usullarning tasnifi
Hozirgi vaqtda santrifüjlashning uchta turi mavjud:
- filtrlash;
- joylashish;
- yorug'lik.
Filtrlash ichki yuzasi mato bilan qoplangan teshikli barabanli sentrifugalarda amalga oshiriladi. Ish bo'shlig'ining aylanishi paytida qattiq fazaning zarralari materialga yotqiziladi: qatlamni bosqichma-bosqich siqish va uni keyinchalik olib tashlash.
Santrifüj sedimentatsiya filtrlashdan ma'lum darajada farq qiladi. Uni amalga oshirish uchun yanada murakkab tuzilmalar qo'llaniladi. Heterojen aralashma asta-sekin o'z o'qi atrofida aylanish harakatlarini amalga oshiradigan ish bo'shlig'iga kiradi. Natijada, qattiq faza baraban devorlariga yotqiziladi va suyuq faza pastki teshikdan muntazam ravishda keladigan heterojen aralashma bilan uning chegaralaridan tashqariga siljiydi.
Santrifüjli tiniqlashtirish yupqaroq kolloid eritmalarni ajratish imkonini beradi. Baraban aylanayotganda zichlik gradienti hosil bo'ladi. Bundan tashqari, engilroq suyuqliklar markazda, og'irroqlari esa - chekkada to'planadi.
Santrifüjni qo'llash
Jarayonning soddaligi tufayli eritmalarni ajratishning ushbu usuli quyidagi sohalarda qo'llanilishini topdi:
- sanoat;
- dori;
- fan.
Usul ko'p yillar davomida yog 'ishlab chiqarish jarayonida tarkibidan suvni olib tashlash orqali uning sifatini yaxshilash uchun faol qo'llanilgan. Tibbiyotda u quyidagi operatsiyalarni bajarish uchun ishlatiladi:
- trombotsitlar massasini chiqarish;
- plazmaferez uchun tozalangan namunalarni olish;
- qizil qon hujayralari sintezi.
Bundan tashqari, quritish shkaflari kabi zamonaviy uskunalar bilan birgalikda santrifüjlash qon quyish uchun tayyorlash imkonini beradi.
Kurs ishi
Santrifüjlash
1. Usulning printsipi
Santrifüj yordamida moddalarni ajratish markazdan qochma maydondagi zarrachalarning har xil xatti-harakatlariga asoslanadi. Probirkaga joylashtirilgan zarrachalar suspenziyasi sentrifuganing harakatlantiruvchi miliga o'rnatilgan rotorga yuklanadi.
Santrifüj maydonda har xil zichlik, shakl yoki o'lchamdagi zarralar turli tezliklarda joylashadi. Cho'kish tezligi rotorning burchak tezligiga va zarracha va aylanish o'qi orasidagi masofaga to'g'ridan-to'g'ri proportsional bo'lgan markazdan qochma tezlashuvga bog'liq:
va markazdan qochma tezlashuv teng bo'ladi)
Rotorning bir aylanishidan beri 2p radian, rotorning burchak tezligi daqiqada aylanishlarda quyidagicha yozilishi mumkin:
Santrifüj tezlashuv odatda birliklarda ifodalanadi g va deyiladi nisbiy markazdan qochma tezlanish, ya'ni.
Zarrachalarni ajratish shartlarini sanab o'tishda rotorning aylanish tezligi va radiusini, shuningdek, santrifüj vaqtini ko'rsating. Santrifüj tezlashuv odatda birliklarda ifodalanadi g, santrifüj trubkasidagi suyuqlik ustunining o'rtacha aylanish radiusidan hisoblangan. Tenglamaga asoslanib, Dole va Kotzias OCP ning rotorning aylanish tezligiga va r radiusiga bog'liqligini ifodalovchi nomogrammani tuzdilar.
Sferik zarrachalarning cho'kish tezligi nafaqat markazdan qochma tezlashuvga, balki zarrachalarning o'zlarining zichligi va radiusiga va suspenziya muhitining yopishqoqligiga ham bog'liq. Sferik zarrachaning suyuq muhitda suyuq meniskdan sentrifuga trubkasi tubiga cho'kishi uchun zarur bo'lgan vaqt cho'kish tezligiga teskari proportsionaldir va quyidagi tenglama bilan aniqlanadi:
qayerda t - sedimentatsiya vaqti sekundlarda, rj - o'rtacha yopishqoqlik, g h - zarracha radiusi, r h - zarrachaning zichligi, p - muhitning zichligi, g m - aylanish o'qidan suyuqlikning meniskiga qadar bo'lgan masofa, g d - aylanish o'qidan probirka tubigacha bo'lgan masofa.
Tenglamadan kelib chiqadigan bo'lsak, ma'lum bir rotor tezligida bir hil sharsimon zarrachalarni cho'ktirish uchun zarur bo'lgan vaqt ularning radiuslari kvadratiga va zarralar va muhitning zichligi farqiga teskari proportsionaldir va uning yopishqoqligiga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir. o'rta. Shuning uchun zichligi va kattaligi jihatidan farq qiluvchi geterogen, taxminan sferik zarrachalar aralashmasini ma’lum tezlanishda probirka tubiga cho‘kishning turli vaqtlari yoki cho‘kindi zarrachalarning cho‘ktiruvchi zarrachalar bo‘ylab taqsimlanishi tufayli ajratish mumkin. ma'lum vaqtdan keyin o'rnatilgan sinov naychasi. Moddalarni ajratishda muhitning zichligi va yopishqoqligi kabi muhim omillarni hisobga olish kerak. Ta'riflangan usullardan foydalanib, hujayra organellalarini to'qima gomogenatlaridan ajratish mumkin. Hujayraning asosiy tarkibiy qismlari quyidagi ketma-ketlikda joylashadi: birinchi navbatda butun hujayralar va ularning bo'laklari, so'ngra yadrolar, xloroplastlar, mitoxondriyalar, lizosomalar, mikrosomalar va eng oxirida ribosomalar. Sferik bo'lmagan zarrachalarning cho'kishi tenglamaga amal qilmaydi, shuning uchun bir xil massali, ammo har xil shakldagi zarralar turli tezlikda joylashadi. Bu xususiyat ultratsentrifugalash yordamida makromolekulalar konformatsiyasini o'rganishda qo'llaniladi.
keyingi biokimyoviy tadqiqotlar uchun biologik materialni izolyatsiya qilishdan iborat. Bunda ko’p miqdorda boshlang’ich biologik material olish mumkin, masalan, to’da yoki uzluksiz kulturalardan mikrob hujayralarini ekish, shuningdek, to’qima kulturasidan va qon plazmasidan o’simlik va hayvon hujayralarini ekish. Preparativ santrifüj yordamida ko'p sonli hujayra zarralari ularning morfologiyasi, tuzilishi va biologik faolligini o'rganish uchun ajratiladi. Usul, shuningdek, oldindan tozalangan preparatlardan DNK va oqsillar kabi biologik makromolekulalarni ajratish uchun ham qo'llaniladi.
Analitik santrifugalash asosan makromolekulalar yoki zarrachalarning sof yoki mohiyatan sof preparatlarini, masalan, ribosomalarni oʻrganish uchun ishlatiladi. Bunda oz miqdorda material ishlatiladi va o'rganilayotgan zarrachalarning cho'kishi maxsus optik tizimlar yordamida doimiy ravishda qayd etiladi. Usul materialning tozaligi, molekulyar og'irligi va tuzilishi haqida ma'lumot olish imkonini beradi. Talabalar uchun seminarlarda preparativ sentrifugalash analitik santrifugadan ko'ra ko'proq qo'llaniladi, shuning uchun biz bu haqda batafsilroq to'xtalamiz, garchi ikkala usul ham umumiy tamoyillarga asoslangan.
2. Tayyor santrifugalash
2.1 Differensial sentrifugalash
Bu usul kattaligi va zichligi jihatidan bir-biridan farq qiluvchi zarrachalarning cho‘kish tezligidagi farqlarga asoslangan. Ajraladigan material, masalan, to'qima gomogenati, markazdan qochma tezlashuvni bosqichma-bosqich oshirish bilan santrifüjlanadi, u har bir bosqichda ma'lum bir qism trubaning pastki qismida yotqizilishi uchun tanlanadi. Har bir bosqich oxirida cho'kma supernatantdan ajratiladi va yakunda toza cho'kma fraktsiyasini olish uchun bir necha marta yuviladi. Afsuski, mutlaqo sof cho'kma olish deyarli mumkin emas; Nima uchun bu sodir bo'lishini tushunish uchun, keling, har bir sentrifuga bosqichining boshida sentrifuga naychasida sodir bo'ladigan jarayonni ko'rib chiqaylik.
Dastlab, gomogenatning barcha zarralari santrifüj trubkasi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi, shuning uchun bitta santrifüj tsiklida eng og'ir zarrachalar cho'kindilarining toza preparatlarini olish mumkin emas: birinchi hosil bo'lgan cho'kindi asosan eng og'ir zarralarni o'z ichiga oladi, lekin, qo'shimcha ravishda, shuningdek, barcha asl komponentlarning ma'lum miqdori. Og'ir zarrachalarning etarlicha toza preparatini faqat dastlabki cho'kindini qayta suspenziyalash va santrifüjlash orqali olish mumkin. Supernatantni markazdan qochma tezlashuvning keyingi ortishi bilan keyingi santrifüjlash o'rta o'lchamdagi va zichlikdagi zarrachalarning cho'kindiga tushishiga, so'ngra eng past zichlikka ega bo'lgan eng kichik zarrachalarning cho'kishiga olib keladi. Shaklda. 2.3-rasmda kalamush jigar gomogenatining fraksiyalanish diagrammasi keltirilgan.
Differensial santrifüjlash, ehtimol, hujayra organellalarini to'qima gomogenatlaridan ajratishning eng keng tarqalgan usulidir. Bu usul kattaligi va zichligi bo'yicha bir-biridan sezilarli darajada farq qiladigan hujayra organellalarini ajratish uchun eng muvaffaqiyatli qo'llaniladi. Ammo bu holatda ham hosil bo'lgan fraktsiyalar hech qachon mutlaqo bir hil bo'lmaydi va ularni keyingi ajratish uchun quyida tavsiflangan boshqa usullar qo'llaniladi. Organoidlar zichligidagi farqlarga asoslangan bu usullar doimiy yoki bosqichma-bosqich zichlik gradienti bo'lgan eritmalarda santrifüjlashni amalga oshirish orqali yanada samarali ajratishni ta'minlaydi. Ushbu usullarning kamchiligi shundaki, eritma zichligi gradientini olish uchun vaqt kerak bo'ladi.
2.2 Zonali tezlikda santrifüjlash
Tezlik-zonal usul yoki, shuningdek, s-zonal sentrifugalash, doimiy zichlik gradienti bo'lgan eritma yuzasida sinov namunasini qatlamlashdan iborat. Keyin zarrachalar diskret zonalar yoki chiziqlar bo'ylab gradient bo'ylab taqsimlanmaguncha namuna santrifüj qilinadi. Zichlik gradientini yaratish orqali konveksiya natijasida yuzaga keladigan zonalarning aralashishiga yo'l qo'yilmaydi. Tezlik zonasi santrifüjlash usuli RNK-DNK gibridlarini, ribosoma bo'linmalarini va boshqa hujayrali komponentlarni ajratish uchun ishlatiladi.
2.3 Izopiknik santrifugalash
Izopiknik santrifüjlash ham zichlik gradientida, ham odatdagi usulda amalga oshiriladi. Agar sentrifugalash zichlik gradientida amalga oshirilmasa, avvalo preparat sentrifugalanadi, shunda molekulyar og'irligi o'rganilayotgan zarrachalarnikidan kattaroq bo'lgan zarralar cho'kadi. Ushbu og'ir zarralar tashlanadi va namuna zichligi izolyatsiya qilinadigan fraktsiya bilan bir xil bo'lgan muhitda to'xtatiladi, so'ngra qiziq zarralar naycha tubiga joylashguncha va pastroq zichlikdagi zarralar suzmaguncha santrifüj qilinadi. suyuqlik yuzasi ..
Yana bir usul - namunani eritma yuzasiga aralashmaning barcha tarkibiy qismlarining zichlik oralig'ini qamrab oladigan doimiy zichlik gradienti bilan qatlamlashdir. Santrifüjlash zarrachalarning suzuvchi zichligi mos keladigan zonalarning zichligiga teng bo'lgunga qadar, ya'ni zarralar zonalarga ajratilguncha amalga oshiriladi. Usul zonal-izopiknal yoki rezonansli santrifüj deb ataladi, chunki bu erda asosiy nuqta zarrachalarning o'lchami yoki shakli emas, balki suzuvchi zichlikdir. Zarrachalarning izopiknal chiziqlar hosil qilish zichligiga suspenziya muhitining tabiati ta'sir qiladi; zarralar eritmadagi ba'zi birikmalar uchun o'tkazuvchan va boshqalarni o'tkazmaydigan bo'lishi mumkin yoki ular eritma molekulalarini biriktirishi mumkin. Zonali rotordan foydalanilganda mitoxondriyalar, lizosomalar, peroksizomalar va mikrosomalar mos ravishda 1,18, 1,21, 1,21 va 1,10 g-sm -3 zichlikka mos keladigan 42%, 47%, 47% va 27% saxarozaga ega bo'lgan bantlarda to'planadi. Hujayra osti organellalarining zichligi ularning ma'lum birikmalarni tanlab singishiga ham bog'liq. Gemolizga olib kelmaydigan Triton WR-1339 yuvish vositasini kalamushlarga yuborish jigar lizosomalari hajmining oshishiga va zichligining pasayishiga olib keladi; mitoxondriya va peroksizomalarning zichligi o'zgarishsiz qoladi. Lizosomalarning sedimentatsiya xususiyatlari, qoida tariqasida, o'zgarmasligiga qaramay, ularning saxaroza gradientidagi muvozanat zichligi 1,21 dan 1,1 gacha kamayadi, bu esa lizosomal-peroksisomal fraktsiyaning mos ravishda ajralishiga olib keladi. Bu xususiyat lizosomalarni, mitoxondriyalarni va peroksisomalarni miqdoriy ajratishda, mikrosomalarnikidan kattaroq zichlikka ega bo'lgan barcha zarrachalarni bir hil muhitdan olib tashlash va keyinchalik cho'kma og'ir zarrachalarni izopiknal sentrifugalash asosida qo'llaniladi.
2.4 Muvozanat zichligi gradienti sentrifugalash
Zichlik gradientini yaratish uchun og'ir metallarning tuzlari, masalan, rubidiy yoki seziy, shuningdek, sukroz eritmalari ishlatiladi. Namuna, masalan, DNK, seziy xloridning konsentrlangan eritmasi bilan aralashtiriladi. Eriydigan modda ham, erituvchi ham dastlab butun hajmda bir tekis taqsimlanadi. Santrifüjlash paytida seziy ionlari katta massaga ega bo'lganligi sababli kontsentratsiyaning muvozanat taqsimoti va natijada CsCl zichligi o'rnatiladi. Santrifüj tezlashuvi ta'sirida DNK molekulalari qayta taqsimlanadi, tegishli zichlikka ega bo'lgan probirkaning bir qismida alohida zona shaklida to'planadi. Usul asosan analitik sentrifugalashda qo'llaniladi va Meselson va Stahl tomonidan DNK replikatsiyasi mexanizmini o'rganish uchun ishlatilgan. E. coli . Muvozanat zichligi gradienti santrifüjlash ham inson qon plazmasidagi lipoproteinlarni ajratish va o'rganish usullaridan biridir.
2. 5 Gradientlarni yaratish va chiqarish
2.5.1 Gradientlarning tabiati
Eritmalarda zichlik gradientlarini yaratish uchun saxaroza eritmalari ko'pincha ishlatiladi, ba'zan esa belgilangan pH bilan. Ba'zi hollarda oddiy suv o'rniga D 2 0 dan foydalanganda yaxshi ajralish olinadi.Jadvalda. 2.1-jadvalda ba'zi saxaroza eritmalarining xossalari keltirilgan.
Gradientni tanlash aniq fraksiyalash maqsadlari bilan belgilanadi. Masalan, Pharmacia Fine Chemicals tomonidan ishlab chiqarilgan Fikol yuqori zichlik va past osmotik bosimga ega gradientlarni yaratish zarur bo'lgan hollarda sukrozni almashtirishi mumkin. Fikolning yana bir afzalligi shundaki, u hujayra membranalaridan o'tmaydi. Yuqori zichlikdagi gradientlarni yaratish uchun rubidiy va seziy kabi og'ir metallarning tuzlari qo'llaniladi, ammo CsCl ning korroziy ta'siri tufayli bunday gradientlar faqat titan kabi chidamli metallardan yasalgan rotorlarda qo'llaniladi.
2.5.2 Bosqichli zichlik gradientini yaratish usuli
Zichlik gradientini yaratish uchun zichligi ketma-ket pasaygan bir nechta eritmalar diqqat bilan santrifüj trubkasiga pipetlanadi. Keyin namuna eng past zichlikka ega bo'lgan eng yuqori qatlamga tor zona shaklida qatlamlanadi, shundan so'ng trubka santrifüj qilinadi. Silliq chiziqli gradientlarni eritma uzoq vaqt turganda qadam gradientlarini tekislash orqali olish mumkin. Naychaning tarkibini tel bilan muloyimlik bilan aralashtirish yoki naychani muloyimlik bilan silkitish orqali jarayonni tezlashtirish mumkin.
2.5.3 Silliq zichlik gradientini yaratish usuli
Ko'pgina hollarda, silliq zichlik gradientini yaratish uchun maxsus qurilma ishlatiladi. U qat'iy belgilangan bir xil diametrli ikkita silindrsimon tomirlardan iborat bo'lib, ular pastki qismida nazorat valfi bo'lgan shisha trubka yordamida bir-biri bilan aloqa qiladi, bu ikkala idishning tarkibini aralashtirish nisbatlarini tartibga solish imkonini beradi. Ulardan biri aralashtirgich bilan jihozlangan va eritma sentrifuga naychalariga oqib o'tadigan chiqish joyiga ega. Zichroq eritma mikserga joylashtiriladi; ikkinchi tsilindr pastroq zichlikdagi eritma bilan to'ldiriladi. Ikkala tsilindrdagi eritma ustunining balandligi ulardagi gidrostatik bosim bir xil bo'lishi uchun o'rnatiladi. Zichroq eritma mikserdan asta-sekin santrifüj naychalariga chiqariladi va bir vaqtning o'zida nazorat valfi orqali ikkinchi tsilindrdan mikserga kiradigan past zichlikdagi eritmaning teng hajmi bilan almashtiriladi. Aralashtirgichdagi eritmaning bir xilligi eritmani aralashtirgich yordamida doimo aralashtirish orqali ta'minlanadi. Eritma sentrifuga naychalariga quyilganda uning zichligi pasayadi va quvurlarda chiziqli zichlik gradienti hosil bo'ladi. Nonchiziqli gradientlar teng bo'lmagan diametrli ikkita silindrdan iborat tizim yordamida yaratilishi mumkin.
Har xil tiklikdagi zichlik gradientlarini hosil qilish uchun teng bo'lmagan zichlikdagi eritmalar bilan to'ldirilgan ikkita mexanik boshqariladigan shpritslar tizimi qo'llaniladi. Pistonlarning nisbiy tezligini o'zgartirish orqali turli xil gradyanlar yaratilishi mumkin.
2.5.4 Santrifuga naychalaridan gradientlarni olib tashlash
Santrifüj va zarrachalarni ajratish tugallangandan so'ng, hosil bo'lgan zonalarni olib tashlash kerak. Bu bir necha usulda, ko'pincha joy almashtirish orqali amalga oshiriladi. Santrifüj trubkasi tagida teshiladi va uning pastki qismiga juda zich muhit, masalan, 60-70% saxaroza eritmasi asta-sekin kiritiladi. Yuqoridagi eritma siljiydi va fraktsiyalar shprits, pipetka yoki naycha orqali fraksiya kollektoriga ulangan maxsus qurilma yordamida yig'iladi. Agar naychalar tsellyuloid yoki nitroselülozdan tayyorlangan bo'lsa, fraktsiyalar naychani maxsus pichoq bilan kesish orqali chiqariladi. Buning uchun stendga mahkamlangan santrifüj trubkasi to'g'ridan-to'g'ri kerakli maydon ostidan kesiladi va fraksiya shprits yoki pipetka bilan so'riladi. Kesish moslamasining mos dizayni bilan eritmaning yo'qolishi minimal bo'ladi. Fraksiyalar, shuningdek, ingichka ichi bo'sh igna bilan naychaning asosini teshish orqali yig'iladi. Naychadan igna orqali oqadigan tomchilar keyingi tahlil qilish uchun fraksiya kollektorida yig'iladi.
2.5.5 Preparat sentrifugalari va ularning qo'llanilishi
Preparatli sentrifugalarni uchta asosiy guruhga bo'lish mumkin: umumiy maqsadli sentrifugalar, yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar va preparativ ultratsentrifugalar. Umumiy maqsadli sentrifugalar maksimal tezlikni 6000 rpm -1 va umumiy tezlikni 6000 gacha bering g . Ular bir-biridan faqat quvvati bilan farq qiladi va bir qator almashtiriladigan rotorlarga ega: burchakli va osilgan stakan bilan. Ushbu turdagi sentrifugalarning xususiyatlaridan biri ularning katta sig'imi - 4 dan 6 dm 3 gacha bo'lib, bu ularni nafaqat 10,50 va 100 sm 3 santrifüj naychalari bilan, balki 1,25 gacha bo'lgan sig'imli idishlar bilan ham yuklash imkonini beradi. dm 3. Ushbu turdagi barcha sentrifugalarda rotorlar qo'zg'aysan miliga qattiq o'rnatilgan bo'lib, santrifüj naychalari tarkibi bilan birga ehtiyotkorlik bilan muvozanatlangan bo'lishi va og'irligi 0,25 g dan oshmasligi kerak.Turbalarning toq soni bo'lmasligi kerak. rotorga yuklangan va agar rotor to'liq yuklanmagan bo'lsa, quvurlar nosimmetrik tarzda bir-biriga qarama-qarshi joylashtirilishi kerak, bu esa rotorning aylanish o'qiga nisbatan quvurlarning teng taqsimlanishini ta'minlaydi.
Yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar maksimal tezlikni 25 000 rpm -1 va umumiy tezlikni 89 000 g gacha bering. Rotor kamerasi rotor aylanayotganda ishqalanish tufayli yuzaga keladigan issiqlikni oldini oluvchi sovutish tizimi bilan jihozlangan. Qoidaga ko'ra, yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar 1,5 dm 3 sig'imga ega va burchakli va osilgan stakan bilan almashtiriladigan rotorlar bilan jihozlangan.
Tayyorlovchi ultratsentrifugalar maksimal tezlikni 75 000 rpm -1 gacha va maksimal markazdan qochma tezlashuvni 510 000 ga bering g . Havo bilan ishqalanish tufayli rotorning haddan tashqari qizib ketishiga yo'l qo'ymaslik uchun ular sovutgich va vakuum birligi bilan jihozlangan. Bunday sentrifugalarning rotorlari yuqori quvvatli alyuminiy yoki titanium qotishmalaridan tayyorlanadi. Alyuminiy qotishmalaridan tayyorlangan rotorlar asosan ishlatiladi, lekin ayniqsa yuqori tezlik talab qilinadigan hollarda titandan tayyorlangan rotorlar qo'llaniladi. Santrifüj naychalarining notekis to'ldirilishi tufayli rotor muvozanatining buzilishidan kelib chiqadigan tebranishlarni kamaytirish uchun ultratsentrifugalar egiluvchan milga ega. Santrifüj naychalari va ularning tarkibini 0,1 g gacha ehtiyotkorlik bilan muvozanatlash kerak.Umumiy maqsadli santrifugalarning rotorlarini yuklashda shunga o'xshash talablarga rioya qilish kerak.
2.6 Rotor dizayni
2.6.1 Burchakli rotorlar va osilgan kosalar bilan rotorlar
Tayyor santrifüj rotorlari odatda ikki xil bo'ladi - burchakli va osilgan kosali. Ular burchakli deb ataladi, chunki ularda joylashgan santrifüj naychalari doimo aylanish o'qiga ma'lum bir burchak ostida bo'ladi. Stakan osilgan rotorlarda probirkalar vertikal ravishda o'rnatiladi va hosil bo'lgan markazdan qochma kuch ta'sirida aylantirilganda ular gorizontal holatga o'tadi; aylanish o'qiga moyillik burchagi 90 ° ga teng.
To'g'ri burchakli rotorlarda zarrachalarning probirkaning mos devorigacha bo'lgan masofasi juda kichik va shuning uchun cho'kish nisbatan tez sodir bo'ladi. Probirkaning devorlari bilan to'qnashgandan so'ng, zarrachalar pastga siljiydi va pastki qismida cho'kindi hosil qiladi. Santrifüjlash paytida konveksiya oqimlari paydo bo'ladi, bu esa o'xshash cho'kindi xususiyatlariga ega bo'lgan zarrachalarni ajratishni ancha murakkablashtiradi. Shunga qaramay, shunga o'xshash dizayndagi rotorlar cho'kish tezligi sezilarli darajada farq qiladigan zarralarni ajratish uchun muvaffaqiyatli qo'llaniladi.
To'xtatilgan stakanli rotorlarda konveksiya hodisalari ham kuzatiladi, ammo ular unchalik aniq emas. Konvektsiya markazdan qochma tezlanish ta'sirida zarrachalarning aylanish o'qiga qat'iy perpendikulyar bo'lmagan yo'nalishda joylashishi va shuning uchun burchakli rotorlarda bo'lgani kabi, ular probirkaning devorlariga urilib, probirkaga siljishi natijasidir. pastki.
Konvektsiya va vorteks ta'siridan ma'lum darajada osilgan idish rotorlarida sektorli quvurlardan foydalanish va rotor tezligini sozlash orqali oldini olish mumkin; Zichlik gradienti santrifüjlash usuli ham yuqorida sanab o'tilgan kamchiliklarga ega emas.
2.6.2 Uzluksiz rotorlar
Uzluksiz rotorlar katta hajmli suspenziyalardan nisbatan kichik miqdordagi qattiq materialni yuqori tezlikda fraksiyalash uchun mo'ljallangan, masalan, hujayralarni madaniy muhitdan ajratish uchun. Santrifüj paytida rotorga zarrachalarning suspenziyasi doimiy ravishda qo'shiladi; Rotorning o'tkazuvchanligi yotqizilgan preparatning tabiatiga bog'liq va daqiqada 100 sm 3 dan 1 dm 3 gacha o'zgarib turadi. Rotorning o'ziga xos xususiyati shundaki, u maxsus dizayndagi izolyatsiya qilingan kameradir; uning tarkibi tashqi muhit bilan aloqa qilmaydi va shuning uchun ifloslanmaydi yoki tarqalmaydi.
2.6.3 Zona rotorlari yoki Anderson rotorlari
Zonal rotorlar alyuminiy yoki titanium qotishmalaridan tayyorlangan bo'lib, ular juda muhim markazdan qochma tezlashuvlarga bardosh berishga qodir. Ular odatda olinadigan qopqoq bilan yopilgan silindrsimon bo'shliqqa ega. Bo'shliqning ichida, aylanish o'qida, rotor bo'shlig'ini to'rtta sektorga bo'ladigan pichoqlari bo'lgan nozul o'rnatilgan eksenel trubka mavjud. Pichoqlar yoki to'siqlar radial kanallarga ega bo'lib, ular orqali eksenel trubadan rotorning chetiga gradient majburlanadi. Pichoqlarning bunday dizayni tufayli konveksiya minimal darajaga tushiriladi.
Rotor taxminan 3000 rpm -1 tezlikda aylanganda to'ldiriladi. Oldindan yaratilgan gradient rotorga eng past zichlikdagi qatlamdan boshlab pompalanadi, u rotorning periferiyasi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi va markazdan qochma kuch tufayli uning tashqi devorida aylanish o'qiga perpendikulyar bo'ladi. . Keyinchalik yuqori zichlikdagi gradient qatlamlari qo'shilganda, kamroq zich qatlamlar markaziga doimiy siljish mavjud. Rotorga butun gradient pompalangandan so'ng, u "yostiq" deb nomlangan eritma bilan to'liq hajmga to'ldiriladi, uning zichligi oldindan tuzilgan gradientning eng yuqori zichligiga mos keladi yoki biroz oshadi.
Keyin eksenel trubka orqali sinov namunasi qatlamlanadi , pastki zichlikdagi eritma yordamida trubadan rotor hajmiga majburan chiqariladi, shu bilan birga "yostiq" ning bir xil hajmi periferiyadan chiqariladi. Ushbu protseduralarning barchasidan so'ng, rotorning aylanish tezligi ish tezligiga keltiriladi va kerakli vaqt oralig'ida zonal tezlik yoki zonal-izopik fraksiyalash amalga oshiriladi. . Fraksiyalarni olish 3000 rpm -1 rotor tezligida amalga oshiriladi. Rotorning tarkibi chetdan "yostiq" qo'shilishi bilan almashtiriladi; birinchi navbatda kamroq zich qatlamlar siljiydi. . Anderson rotorining eksenel kanalining maxsus dizayni tufayli, ular joy o'zgartirilganda zonalarni aralashtirish sodir bo'lmaydi. Chiqish gradienti yozib olish moslamasi, masalan, spektrofotometrning hujayrasi orqali o'tkaziladi, uning yordamida oqsil tarkibini 280 nm yutilish orqali yoki maxsus radioaktivlik detektori orqali aniqlash mumkin, shundan so'ng fraktsiyalar yig'iladi.
O'rtacha tezlikda ishlatiladigan zonal rotorlarning quvvati 650 dan 1600 sm 3 gacha o'zgarib turadi, bu esa juda katta miqdordagi materialni olish imkonini beradi. Zona rotorlari turli preparatlardan oqsil aralashmalarini olib tashlash va mitoxondriyalarni, lizosomalarni, polisomalarni va oqsillarni ajratish va tozalash uchun ishlatiladi.
2.6.4 Hujayra osti fraksiyalarini tahlil qilish
Preparatni fraksiyalash jarayonida olingan hujayra osti zarrachalarining xossalari, agar preparat tarkibida aralashmalar bo'lmasa, zarrachalarning o'ziga xos xususiyatlariga bog'liq bo'lishi mumkin. Shuning uchun, natijada olingan preparatlarning tozaligini har doim baholash kerak. Gomogenizatsiya samaradorligi va preparatdagi aralashmalarning mavjudligi mikroskopik tekshirish yordamida aniqlanishi mumkin. Biroq, ko'rinadigan aralashmalarning yo'qligi hali preparatning tozaligining ishonchli dalili emas. Sofligini aniqlash uchun olingan preparat kimyoviy tahlildan o'tkaziladi, bu uning oqsil yoki DNK tarkibini, iloji bo'lsa, fermentativ faolligini va immunologik xususiyatlarini aniqlash imkonini beradi.
Fraksiyalangan to'qimalarda fermentlarning tarqalishini tahlil qilish ikkita umumiy tamoyilga asoslanadi. Ulardan birinchisi, ma'lum bir hujayra osti populyatsiyasining barcha zarralari bir xil fermentlar to'plamini o'z ichiga oladi. Ikkinchisi, har bir ferment hujayra ichidagi ma'lum bir joyda lokalizatsiya qilinganligini taxmin qiladi. Agar bu pozitsiya to'g'ri bo'lsa, fermentlar mos keladigan organellalar uchun marker bo'lishi mumkin edi: masalan, sitoxrom oksidaza va monoamin oksidaza mitoxondriya uchun marker fermenti, kislota gidrolazalari lizosomalar uchun marker, katalaza peroksisomalar uchun marker va glyukoza- 6-fosfataza - mikrosomal membranalarning belgisi. Ammo ma'lum bo'ldiki, ba'zi fermentlar, masalan, malatdehidrogenaza. R-glyukuronidaza, NADP H-sitoxrom c reduktaza bir nechta fraktsiyalarda lokalizatsiya qilingan.Shuning uchun har bir alohida holatda subhujayra fraktsiyalari uchun marker fermentlarni tanlashga juda ehtiyotkorlik bilan yondashish kerak.Bundan tashqari, marker fermenti yo'qligi bu degani emas. mos keladigan organellalarning yo'qligi, ehtimol, fraksiyalash jarayonida ferment organellalardan yo'qoladi yoki inhibe qilinadi yoki inaktivlanadi, shuning uchun odatda har bir fraksiya uchun kamida ikkita ferment belgilari aniqlanadi.
Fraksiya |
Hajmi, sm" |
Umumiy naslchilik |
Tekshirish, 660 nm |
Ferment faollik birliklari |
Fraksiyadagi faoliyat natijasi,% |
2.7 Differensial sentrifugalash orqali fraksiyalash
2.7.1 Natijalarni taqdim etish
To'qimalarni fraksiyalashdan olingan natijalar eng qulay tarzda grafiklar shaklida taqdim etiladi. Shunday qilib, fermentlarning to'qimalarda tarqalishini o'rganishda ma'lumotlar eng yaxshi gistogrammalar shaklida taqdim etiladi, bu esa tajribalar natijalarini vizual baholash imkonini beradi.
Namunadagi fermentativ faollikdagi oqsil miqdori asl gomogenatda ham, har bir ajratilgan hujayra osti fraksiyasida ham alohida aniqlanadi. Fraksiyalardagi umumiy fermentativ faollik va oqsil miqdori asl gomogenatdagi mos qiymatlardan unchalik farq qilmasligi kerak.
Keyin har bir fraksiyadagi fermentativ faollik va oqsil miqdori umumiy hosilning foizi sifatida hisoblanadi, uning asosida gistogramma tuziladi. Har bir fraksiyadagi oqsilning nisbiy miqdori ularning ajratilish tartibi bo‘yicha abscissa o‘qi bo‘ylab ketma-ket, har bir fraksiyaning nisbiy solishtirma faolligi esa ordinata o‘qi bo‘ylab chiziladi. Shunday qilib, har bir fraksiyaning fermentativ faolligi ustunlar maydoni bilan belgilanadi.
2.7.2 Analitik ultratsentrifugalash
Maqsadi moddalarni ajratish va ularni tozalashdan iborat preparativ sentrifugalashdan farqli o'laroq, analitik ultratsentrifugalash asosan biologik makromolekulalar va boshqa tuzilmalarning cho'ktirish xususiyatlarini o'rganish uchun ishlatiladi. Shuning uchun, analitik santrifüjlashda maxsus dizayndagi rotorlar va ro'yxatga olish tizimlari qo'llaniladi: ular materialning cho'kindi jinsini doimiy ravishda kuzatib borish imkonini beradi. V markazdan qochma maydon.
Analitik ultratsentrifugalar 70 000 rpm -1 gacha tezlikka erisha oladi, shu bilan birga 500 000 gacha markazdan qochma tezlanish hosil qiladi. g . Ularning rotori, qoida tariqasida, ellipsoid shakliga ega va rotorning aylanish tezligini o'zgartirishga imkon beruvchi tor orqali dvigatelga ulanadi. Rotor sovutish moslamasi bilan jihozlangan vakuum kamerasida aylanadi va aylanish o'qiga parallel ravishda santrifüjda qat'iy vertikal ravishda o'rnatiladigan analitik va muvozanatlashtiruvchi ikkita hujayraga ega. Balanslash xujayrasi analitik hujayrani muvozanatlash uchun xizmat qiladi va aniq tizimga ega bo'lgan metall blokdir. Shuningdek, u aylanish o'qidan qat'iy belgilangan masofada joylashgan ikkita indeksli teshikka ega bo'lib, ular yordamida analitik katakdagi mos masofalar aniqlanadi. Odatda sig'imi 1 sm 3 bo'lgan analitik hujayra sektor shakliga ega. Rotorga to'g'ri o'rnatilganda, u vertikal holatda turishiga qaramay, u osilgan stakanli rotor bilan bir xil printsip asosida ishlaydi va deyarli ideal cho'kindi sharoitlarini yaratadi. Analitik hujayraning uchlarida kvarts oynali oynalar mavjud. Analitik ultratsentrifugalar butun sentrifugalash davrida zarrachalar cho'kindiligini kuzatish imkonini beruvchi optik tizimlar bilan jihozlangan. Belgilangan vaqt oralig'ida cho'kindi materialni suratga olish mumkin. Oqsillar va DNKlarni fraksiyalashda cho'kindilanish ultrabinafsha nurda yutilish orqali va o'rganilayotgan eritmalar turli xil sinishi ko'rsatkichlariga ega bo'lgan hollarda - Schlieren tizimi yoki Rayleigh interferentsiya tizimi yordamida nazorat qilinadi. Oxirgi ikkita usul yorug'lik turli zichlikdagi zonalardan tashkil topgan shaffof eritmadan o'tganda, zonalar chegarasida yorug'lik sinishi sodir bo'lishiga asoslanadi. Cho'kish paytida og'ir va engil zarralar bo'lgan zonalar o'rtasida chegara hosil bo'lib, u sindiruvchi linza vazifasini bajaradi; bu holda detektor sifatida ishlatiladigan fotografik plastinkada tepalik paydo bo'ladi. Cho'kish paytida chegara harakatlanadi va natijada cho'qqi, uning tezligi bo'yicha materialning cho'kish tezligini baholash mumkin. Interferometrik tizimlar shlieren tizimlariga qaraganda sezgirroq. Analitik hujayralar eng ko'p ishlatiladigan bir sektorli va erituvchi va erigan moddalarni qiyosiy o'rganish uchun ishlatiladigan ikki sektorli.
Biologiyada analitik ultratsentrifugalash makromolekulalarning molekulyar og'irliklarini aniqlash, olingan namunalarning tozaligini tekshirish, shuningdek, makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganish uchun ishlatiladi.
2.8 Analitik ultratsentrifugalashning qo'llanilishi
2.8.1 Molekulyar og'irliklarni aniqlash
Analitik ultratsentrifugalash yordamida molekulyar og'irliklarni aniqlashning uchta asosiy usuli mavjud: cho'kish tezligini aniqlash, cho'kma muvozanat usuli va cho'kma muvozanatini yaqinlashish usuli.
Sedimentatsiya tezligi bo'yicha molekulyar og'irlikni aniqlash - bu eng keng tarqalgan usul. Santrifüjlash yuqori tezlikda amalga oshiriladi, shunda dastlab butun hajm bo'ylab bir tekis taqsimlangan zarralar aylanish markazidan radius bo'ylab tartibli harakatlana boshlaydi. Erituvchining allaqachon zarralardan xoli bo'lgan hududi va ularni o'z ichiga olgan qism o'rtasida aniq interfeys hosil bo'ladi. Bu chegara sentrifugalash vaqtida harakatlanadi, bu esa yuqoridagi usullardan biri yordamida zarrachalarning cho`kish tezligini aniqlash, bu harakatni fotoplastinkaga yozib olish imkonini beradi.
Sedimentatsiya tezligi quyidagi bog'liqlik bilan belgilanadi:
Qayerda X - aylanish o'qidan masofa sm,
t - s da vaqt,
w - rad-s da burchak tezligi -1,
s - molekulaning sedimentatsiya koeffitsienti.
Cho'kish koeffitsienti - bu tezlashuv birligining tezligi, u bilan o'lchanadi Seedberg birliklari ; 1 Svedberg birligi 10_13 s ga teng. s ning son qiymati zarrachalarning molekulyar og'irligi va shakliga bog'liq bo'lib, berilgan molekula yoki supramolekulyar tuzilishga xos bo'lgan qiymatdir. Masalan, lizozimning sedimentatsiya koeffitsienti 2,15 S; katal aza sedimentatsiya koeffitsienti 11,35S, bakterial ribosoma subbirliklari 30 dan 50S gacha, eukaryotik ribosomalar 40 dan 60S gacha.
Qayerda M - molekulaning molekulyar og'irligi, R - gaz doimiyligi, T - mutlaq harorat, s - molekulaning cho'kish koeffitsienti, D - molekulaning diffuziya koeffitsienti, v - bir gramm erigan moddaning egallagan hajmi deb hisoblanishi mumkin bo'lgan qisman solishtirma hajm, p - erituvchining zichligi.
Sedimentatsiyaning muvozanat usuli. Bu usul bilan molekulyar og'irliklarni aniqlash rotorning nisbatan past tezliklarida, 7000-8000 rpm -1 tartibida amalga oshiriladi, shuning uchun katta molekulyar og'irlikdagi molekulalar tubiga cho'kmaydi. Ultratsentrifugalash bir tomondan markazdan qochma kuchlar, ikkinchi tomondan diffuziya kuchlari taʼsirida oʻrnatiladigan zarrachalar muvozanat holatiga kelguncha, yaʼni zarrachalar harakati toʻxtaguncha amalga oshiriladi. Keyin hosil bo'lgan kontsentratsiya gradientidan moddaning molekulyar og'irligi formula bo'yicha hisoblanadi
Qayerda R - gaz doimiyligi, T - mutlaq harorat, ō - burchak tezligi, p - erituvchi zichligi, v - qisman o'ziga xos hajm; Bilan X Va Bilan 2 - masofadagi eritma konsentratsiyasi G G va aylanish o'qidan g 2.
Ushbu usulning nochorligi shundaki, cho'kma muvozanatiga erishish uchun u uzoq vaqt talab etadi - sentrifuganing uzluksiz ishlashi bilan bir necha kundan bir necha haftagacha.
Sedimentatsiya muvozanatiga yaqinlashish usuli avvalgi usulning muvozanatni o'rnatish uchun ko'p vaqt talab qilinishi bilan bog'liq kamchiliklaridan xalos bo'lish maqsadida ishlab chiqilgan.Ushbu usul yordamida sentrifugalangan eritmaning molekulyar og'irliklarini aniqlash mumkin. Muvozanatga yaqinlashadi.Birinchidan, makromolekulalar analitik hujayraning butun hajmi bo‘ylab bir tekis taqsimlanadi, so‘ngra sentrifugalash davom etar ekan, molekulalar joylashadi va meniskus sohasidagi eritma zichligi asta-sekin pasayadi.Zichlikning o‘zgarishi. Ehtiyotkorlik bilan qayd etiladi va keyin ko'p sonli o'zgaruvchilarni o'z ichiga olgan murakkab hisob-kitoblar orqali berilgan birikmaning molekulyar og'irligi formulalar yordamida aniqlanadi:
Qayerda R - gaz doimiyligi, T - mutlaq harorat; v - qisman solishtirma hajmi, p - erituvchi zichligi, dcldr - makromolekulaning konsentratsiya gradienti, g m va g d - menisk va probirka tubiga bo'lgan masofa, mos ravishda, s m va s d - mos ravishda menisk va probirkaning pastki qismidagi makromolekulalar konsentratsiyasi; M m Va M R - mos ravishda menisk va probirkaning pastki qismidagi modda kontsentratsiyasining taqsimlanishidan aniqlangan molekulyar og'irlik qiymatlari.
2.8.2 Dori vositalarining tozaligini baholash
Analitik ultratsentrifugalash DNK, virus va oqsil preparatlarining tozaligini baholash uchun keng qo'llaniladi. Preparatlarning tozaligi, shubhasiz, molekulaning molekulyar og'irligini aniq aniqlash zarur bo'lgan hollarda juda muhimdir. Ko'pgina hollarda preparatning bir jinsliligini cho'kindilanish chegarasining tabiatiga ko'ra, cho'kish tezligini aniqlash usuli yordamida baholash mumkin: bir hil preparat odatda bitta aniq chegarani beradi. Preparatda mavjud bo'lgan nopokliklar qo'shimcha tepalik yoki elka sifatida paydo bo'ladi; ular asosiy tepalikning assimetriyasini ham aniqlaydilar.
2.8.3 Makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganish
Analitik ultratsentrifugalashni qo'llashning yana bir sohasi makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganishdir. Masalan, DNK molekulasi bir yoki ikki zanjirli, chiziqli yoki aylana bo'lishi mumkin. Turli birikmalar ta'sirida yoki yuqori haroratda DNK bir qator qaytar va qaytarilmas konformatsion o'zgarishlarga uchraydi, ularni namunaning cho'kish tezligining o'zgarishi bilan aniqlash mumkin. Molekula qanchalik ixcham bo'lsa, uning eritmadagi ishqalanish koeffitsienti shunchalik past bo'ladi va aksincha: u qanchalik ixcham bo'lsa, ishqalanish koeffitsienti shunchalik katta bo'ladi va shuning uchun u sekinroq cho'kadi. Shunday qilib, namunaga turli xil ta'sirlardan oldin va keyin cho'kish tezligidagi farqlar makromolekulalarda sodir bo'ladigan konformatsion o'zgarishlarni aniqlash imkonini beradi.
Aspartat transkarbamoylaza kabi allosterik oqsillarda konformatsion o'zgarishlar ularning substrat va kichik ligandlar bilan bog'lanishi natijasida yuzaga keladi. Proteinning subbirliklarga ajralishi uni karbamid yoki paraxloromerkuribenzoat kabi moddalar bilan davolash natijasida yuzaga kelishi mumkin. Ushbu o'zgarishlarning barchasini analitik ultratsentrifugalash yordamida osongina kuzatish mumkin.
Usul yordamida quvurli mahsulotlarni shakllantirish santrifüjlash. ostida santrifüjlash qurilish materiallari sanoatida... shunday ta'sirni amalga oshiradiganlar deyiladi santrifüjlash. Belarus Respublikasi sanoatida gorizontal sentrifugalar...
Zarrachalarning cho'kishi
Laboratoriya ishi >> KimyoHujayralar allaqachon past tezlikda chiqariladi santrifüjlash yadrodan, mitoxondriyadan va... ultratsentrifugalash Ushbu turdagi xususiyatlar santrifüjlash o‘zida aks ettirilgan... biz uchun foydalanish namunasi santrifüjlash saxaroza zichligi gradientida, ...
Santrifugadan foydalanish
Kurs ishi >> Sanoat, ishlab chiqarishPartiyali sentrifugalarda turli operatsiyalar santrifüjlash– yuklash, ajratish, tushirish – yuzaga keladi... tayyorlovchi va analitikni ajratadi santrifüjlash. Preparat bilan santrifüjlash boshlang'ich biologik material olinadi ...
Santrifüj usuli santrifüj tomonidan yaratilgan markazdan qochma maydonidagi zarrachalarning turli xil xatti-harakatlariga asoslangan. Santrifüj idishida joylashgan namuna rotorga joylashtiriladi, u markazlashtiruvchi haydovchi tomonidan boshqariladi. Zarrachalar aralashmasini ajratish uchun aylanish tezligi, santrifüj vaqti va rotor radiusi kabi shartlar to'plamini tanlash kerak. Sferik zarralar uchun cho'kish tezligi (cho'kindi) nafaqat tezlanishga, balki zarrachalarning radiusi va zichligiga, shuningdek, namuna yotqizilgan muhitning yopishqoqligiga bog'liq.
Santrifüjlash ikki turga bo'linadi: preparativ va analitik. Tayyor santrifüj, keyingi tadqiqot uchun namunaning bir qismini ajratib olish zarur bo'lganda qo'llaniladi. Bu usul hujayralarni suspenziya, biologik makromolekulalar va boshqalardan ajratish uchun ishlatiladi.
Analitik santrifüjlash markazdan qochma maydonda biologik makromolekulalar harakatini o'rganish uchun ishlatiladi. Ushbu usul namunaning nisbatan kichik hajmlarida joylashgan molekulalarning massasi, shakli va o'lchamlari to'g'risida ma'lumot olish imkonini beradi. Kundalik laboratoriya amaliyotida preparativ sentrifuga ko'pincha uchraydi.
Tayyorlovchi laboratoriya sentrifugalari, o'z navbatida, maqsadiga ko'ra guruhlarga bo'linadi: preparativ ultratsentrifugalar, umumiy maqsadli sentrifugalar va yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar. Umumiy maqsadli santrifüjlar tibbiy laboratoriyalarda eng katta amaliy qo'llanilishiga ega va maksimal tezligi 6 ming rpm gacha. Ushbu turdagi qurilmalarning asosiy xususiyati uning nisbatan katta sig'imi - 6 litrgacha, bu nafaqat hajmi 100 ml gacha bo'lgan santrifuga naychalarini, balki 1,25 litrgacha bo'lgan idishlarni ham santrifüjlash uchun foydalanish imkonini beradi. Barcha umumiy maqsadli santrifüjlarda rotorlar qo'zg'aysan miliga qattiq o'rnatiladi, shuning uchun santrifüjlangan idishlar juda aniq muvozanatlangan bo'lishi kerak. Buzilmasligi uchun rotorga toq sonli naychalarni yuklamang, agar yuk to'liq bo'lmasa, idishlar bir-biriga qarama-qarshi qo'yilishi kerak.
Yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalarning maksimal tezligi 25 ming rpm va tezlashuvi 89 ming g gacha. Rotor va santrifüjlangan namunalarni o'z ichiga olgan kamera rotor yuqori tezlikda aylanayotganda ishqalanishdan kelib chiqadigan isitishning oldini olish uchun sovutish tizimi bilan jihozlangan. Odatda, bunday santrifüjlar 1,5 litrgacha bo'lgan hajmda ishlashi mumkin va burchakli rotorlar yoki almashtiriladigan idishlar bilan jihozlangan rotorlar bilan jihozlangan.
Tayyorlovchi ultratsentrifugalar 75000 rpm gacha tezlashadi va maksimal markazdan qochma tezlashuvi 510 ming g. Rotorning havo bilan ishqalanishidan qizib ketishining oldini olish uchun ular sovutish va vakuum birliklari bilan jihozlangan. Ushbu santrifüjlar uchun rotorlar yuqori quvvatli titanium yoki alyuminiy qotishmalaridan tayyorlanadi. Ultratsentrifugalarning vali, yuqori tezlikda ishlaydigan va preparativ sentrifugalardan farqli o'laroq, rotor muvozanati buzilganda tebranishlarni kamaytirish uchun moslashuvchan holga keltiriladi. Rotordagi idishlar grammning o'ndan bir qismigacha ehtiyotkorlik bilan muvozanatlangan bo'lishi kerak.
Santrifüjlash usuli- bu markazdan qochma kuch yordamida turli xil heterojen aralashmalarning tarkibiy qismlariga ajratish (bo'linish). Buni amalga oshirish uchun santrifugalar deb ataladigan maxsus qurilmalar qo'llaniladi.
Har qanday santrifuganing asosiy qismi probirkalar o'rnatilgan uyalari bo'lgan rotordir. Ultra yuqori tezlikda aylanish jarayonida tizimda markazdan qochma kuch paydo bo'ladi, bu esa qayta ishlangan moddani zichligi bo'yicha ajratish- masalan, suyuqlikda mavjud bo'lgan qattiq zarralar "cho'kindi". Santrifugalash usuli inson faoliyatining deyarli barcha sohalarida: fan va tibbiyotda, sanoatda, qishloq xo'jaligida, kundalik hayotda va texnologik sohalarda qo'llaniladi.
Turli xil sentrifugalash usullari
Moddalarni ajratish uchun cho'ktirishning yana bir usuli qo'llanilishi mumkin - tortishish kuchi ta'sirida ajralish sodir bo'lganda sedimentatsiya. Qoida tariqasida, cho'ktiruvchi qurilmalarda ishlov berish santrifüjdan oldin amalga oshiriladi va ishning tayyorgarlik bosqichidir.
Santrifüjlash usulining o'zi cho'ktirish, filtrlash va tozalashga bo'linadi.
Filtrlash filtr muhiti o'rnatilgan teshikli tambur yordamida amalga oshiriladi. Suyuqlik markazdan qochma kuch ta'sirida u orqali erkin o'tadi, qattiq zarrachalar esa tashqarida qoladi. Uchun himoya qilish Qattiq devorlari bo'lgan barabanlar ishlatiladi, ularning pastki qismiga suspenziya beriladi. Jarayon davomida devorlarga cho'kma chiqariladi va suyuqlik ichki qatlam hosil qiladi, so'ngra chetidan oshib ketadi.
Va nihoyat, yorug'lik markazdan qochma maydon ta'sirida zarrachalarning erkin cho'kish jarayonini ifodalovchi qattiq barabanlarda ham sodir bo'ladi.
Santrifugalash usullarining xarakteristikalari
Jismoniy mohiyatiga ko'ra filtrlash va cho'ktirish usullari juda farq qiladi.
Cho'kma barabanlarida qayta ishlash cho'kindini zichlash va qattiq zarrachalarni cho'ktirish orqali ifloslantiruvchi moddalar va aralashmalar miqdori juda kam bo'lgan suyuqlikni tozalash maqsadida amalga oshiriladi.
Shu bilan birga, bu tortishish kuchidan foydalanadigan jarayondan tubdan farq qiladi - birinchi navbatda, cho'kish juda bir xil jarayon ekanligi va markazdan qochma maydon chiziqlarining parallel bo'lmaganligi sababli santrifugalash juda mos kelmaydigan usuldir. Ikkala usul bir-biridan farq qiladi va buni hisobga olish kerak.
Filtrlash sentrifugalash strukturasi biroz murakkabroq, chunki u odatda uch bosqichda sodir bo'ladi: birinchi navbatda cho'kindi hosil bo'ladi, keyin siqiladi, keyin suyuqlikni yo'q qiladi. Santrifüj kuch bilan filtrlash ham "muntazam" tortishish bilan filtrlashdan juda farq qiladi. Faqat birinchi bosqichni o'xshash deb atash mumkin.
Turli sohalarda santrifüjdan foydalanish
Usul keng tarqaldi va deyarli har qanday faoliyat sohasida qo'llaniladi. Siz uni biologiya va tibbiyot, laboratoriya diagnostikasi va oziq-ovqat sanoati sohasida uchratishingiz mumkin; filtrlash, siqish va tozalashning an'anaviy va kamroq samarali jarayonlarini uzoq va muvaffaqiyatli almashtirdi.
Sanoat santrifugalari Ular katta quvvatga va murakkabroq rotor dizayniga ega, buning natijasida bir vaqtning o'zida ko'plab moddalarni qayta ishlash mumkin. Ular qishloq xo'jaligida asal qoliplaridan asal olish va donni tozalash, sutdan yog'ni ajratish yo'li bilan ajratish uchun ishlatiladi va ular rudani boyitish sohasida ham juda keng tarqalgan. Siz hatto kir yuvish xonasida santrifugani topishingiz mumkin - u erda ular yuvinishdan keyin kiyimlarni aylantiradilar.
Rotor tezligi ancha past bo'lgan laboratoriya santrifugalari qon zardobini, siydik cho'kindilarini ajratish, serologik tadqiqotlar va qizil qon tanachalarini cho'ktirish uchun ishlatiladi. Laboratoriya navlari yana klinik, statsionar, muzlatgichli, stol usti va burchakli kichiklarga bo'linadi: ularning har biri tibbiy markazning maqsad va vazifalariga qarab o'z laboratoriya tadqiqotlari sohasida qo'llaniladi.
Kurs ishi
Santrifüjlash
1. Usulning printsipi
Santrifüj yordamida moddalarni ajratish markazdan qochma maydondagi zarrachalarning har xil xatti-harakatlariga asoslanadi. Probirkaga joylashtirilgan zarrachalar suspenziyasi sentrifuganing harakatlantiruvchi miliga o'rnatilgan rotorga yuklanadi.
Santrifüj maydonda har xil zichlik, shakl yoki o'lchamdagi zarralar turli tezliklarda joylashadi. Sedimentatsiya tezligi quyidagilarga bog'liqmarkazdan qochma tezlashuv, rotorning burchak tezligiga va zarracha va aylanish o'qi orasidagi masofaga to'g'ridan-to'g'ri proportsional:
va markazdan qochma tezlashuv teng bo'ladi)
Rotorning bir aylanishidan beri2p radian, rotorning burchak tezligi daqiqada aylanishlarda quyidagicha yozilishi mumkin:
Santrifüj tezlashuv odatda birliklarda ifodalanadig va deyiladinisbiy markazdan qochma tezlanish , ya'ni.
yoki
Zarrachalarni ajratish shartlarini sanab o'tishda rotorning aylanish tezligi va radiusini, shuningdek, santrifüj vaqtini ko'rsating. Santrifüj tezlashuv odatda birliklarda ifodalanadig , suyuqlik ustunining o'rtacha aylanish radiusidan hisoblanganVsantrifüj trubkasi. Tenglamaga asoslanib, Dole va Kotzias OCP ning rotorning aylanish tezligiga va r radiusiga bog'liqligini ifodalovchi nomogrammani tuzdilar.
Guruch. 2 .1. Markazdan qochma tezlanishni hisoblash uchun nomogramma.
O ni aniqlash uchun rotorning radiusi va aylanish tezligi qiymatlarini o'ta shkalada to'g'ri chiziq bilan ulang; bu chiziqning o'rtacha shkala bilan kesishish nuqtasi markazdan qochma tezlashuvning kerakli qiymatini beradi. Iltimos, shkala raqamlarining o'ng ustuniga e'tibor bering HAQIDA rotor tezligi shkalasidagi raqamlarning o'ng ustuniga mos keladi; chap - chap.
Sferik zarrachalarning cho'kish tezligi nafaqat markazdan qochma tezlashuvga, balki zarrachalarning o'zlarining zichligi va radiusiga va suspenziya muhitining yopishqoqligiga ham bog'liq. Sferik zarrachaning suyuq muhitda suyuq meniskdan sentrifuga trubkasi tubiga cho'kishi uchun zarur bo'lgan vaqt cho'kish tezligiga teskari proportsionaldir va quyidagi tenglama bilan aniqlanadi:
Qayerdat - soniyalarda cho'kish vaqti,rj- muhitning yopishqoqligi,Gh- zarrachalar radiusi, ph- zarracha zichligi, p - o'rtacha zichlik, gm- aylanish o'qidan suyuqlikning meniskiga qadar bo'lgan masofa, gd- aylanish o'qidan probirkaning pastki qismigacha bo'lgan masofa.
Tenglamadan kelib chiqadigan bo'lsak, ma'lum bir rotor tezligida bir hil sharsimon zarrachalarni cho'ktirish uchun zarur bo'lgan vaqt ularning radiuslari kvadratiga va zarralar va muhitning zichligi farqiga teskari proportsionaldir va uning yopishqoqligiga to'g'ridan-to'g'ri proportsionaldir. o'rta. Shuning uchun zichligi va kattaligi jihatidan farq qiluvchi geterogen, taxminan sferik zarrachalar aralashmasini ma’lum tezlanishda probirka tubiga cho‘kishning turli vaqtlari yoki cho‘kindi zarrachalarning cho‘ktiruvchi zarrachalar bo‘ylab taqsimlanishi tufayli ajratish mumkin. ma'lum vaqtdan keyin o'rnatilgan sinov naychasi. Moddalarni ajratishda muhitning zichligi va yopishqoqligi kabi muhim omillarni hisobga olish kerak. Ta'riflangan usullardan foydalanib, hujayra organellalarini to'qima gomogenatlaridan ajratish mumkin. Hujayraning asosiy tarkibiy qismlari quyidagi ketma-ketlikda joylashadi: birinchi navbatda butun hujayralar va ularning bo'laklari, so'ngra yadrolar, xloroplastlar, mitoxondriyalar, lizosomalar, mikrosomalar va eng oxirida ribosomalar. Sferik bo'lmagan zarrachalarning cho'kishi tenglamaga amal qilmaydi, shuning uchun bir xil massali, ammo har xil shakldagi zarralar turli tezlikda joylashadi. Bu xususiyat ultratsentrifugalash yordamida makromolekulalar konformatsiyasini o'rganishda qo'llaniladi.
keyingi biokimyoviy tadqiqotlar uchun biologik materialni izolyatsiya qilishdan iborat. Bunda ko’p miqdorda boshlang’ich biologik material olish mumkin, masalan, to’da yoki uzluksiz kulturalardan mikrob hujayralarini ekish, shuningdek, to’qima kulturasidan va qon plazmasidan o’simlik va hayvon hujayralarini ekish. Preparativ santrifüj yordamida ko'p sonli hujayra zarralari ularning morfologiyasi, tuzilishi va biologik faolligini o'rganish uchun ajratiladi. Usul, shuningdek, oldindan tozalangan preparatlardan DNK va oqsillar kabi biologik makromolekulalarni ajratish uchun ham qo'llaniladi.
Analitik santrifugalash asosan makromolekulalar yoki zarrachalarning sof yoki mohiyatan sof preparatlarini, masalan, ribosomalarni oʻrganish uchun ishlatiladi. Bunda oz miqdorda material ishlatiladi va o'rganilayotgan zarrachalarning cho'kishi maxsus optik tizimlar yordamida doimiy ravishda qayd etiladi. Usul materialning tozaligi, molekulyar og'irligi va tuzilishi haqida ma'lumot olish imkonini beradi. Talabalar uchun seminarlarda preparativ sentrifugalash analitik santrifugadan ko'ra ko'proq qo'llaniladi, shuning uchun biz bu haqda batafsilroq to'xtalamiz, garchi ikkala usul ham umumiy tamoyillarga asoslangan.
2. Tayyor santrifugalash
2 .1 Differensial sentrifugalash
Bu usul kattaligi va zichligi jihatidan bir-biridan farq qiluvchi zarrachalarning cho‘kish tezligidagi farqlarga asoslangan. Ajraladigan material, masalan, to'qima gomogenati, markazdan qochma tezlashuvni bosqichma-bosqich oshirish bilan santrifüjlanadi, u har bir bosqichda ma'lum bir qism trubaning pastki qismida yotqizilishi uchun tanlanadi. Har bir bosqich oxirida cho'kma supernatantdan ajratiladi va yakunda toza cho'kma fraktsiyasini olish uchun bir necha marta yuviladi. Afsuski, mutlaqo sof cho'kma olish deyarli mumkin emas; Nima uchun bu sodir bo'lishini tushunish uchun, keling, har bir sentrifuga bosqichining boshida sentrifuga naychasida sodir bo'ladigan jarayonni ko'rib chiqaylik.
Dastlab, gomogenatning barcha zarralari santrifüj trubkasi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi, shuning uchun bitta santrifüj tsiklida eng og'ir zarrachalar cho'kindilarining toza preparatlarini olish mumkin emas: birinchi hosil bo'lgan cho'kindi asosan eng og'ir zarralarni o'z ichiga oladi, lekin, qo'shimcha ravishda, shuningdek, barcha asl komponentlarning ma'lum miqdori. Og'ir zarrachalarning etarlicha toza preparatini faqat dastlabki cho'kindini qayta suspenziyalash va santrifüjlash orqali olish mumkin. Supernatantni markazdan qochma tezlashuvning keyingi ortishi bilan keyingi santrifüjlash o'rta o'lchamdagi va zichlikdagi zarrachalarning cho'kindiga tushishiga, so'ngra eng past zichlikka ega bo'lgan eng kichik zarrachalarning cho'kishiga olib keladi. Shaklda. 2.3-rasmda kalamush jigar gomogenatining fraksiyalanish diagrammasi keltirilgan.
Guruch. 2.2. Santrifüj maydonda zarrachalar suspenziyasining differentsial sentrifugalanishi.
Birinchidan, zarralar santrifüj trubasining butun hajmi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi (A): Santrifüjlash paytida zarralar o'lchamlari va shakliga qarab cho'ktiriladi (b - d).
Guruch. 2.3. Sichqoncha jigar gomogenatining hujayra osti fraksiyalarga bo'linish sxemasi.
Differensial santrifüjlash, ehtimol, hujayra organellalarini to'qima gomogenatlaridan ajratishning eng keng tarqalgan usulidir. Bu usul kattaligi va zichligi bo'yicha bir-biridan sezilarli darajada farq qiladigan hujayra organellalarini ajratish uchun eng muvaffaqiyatli qo'llaniladi. Ammo bu holatda ham hosil bo'lgan fraktsiyalar hech qachon mutlaqo bir hil bo'lmaydi va ularni keyingi ajratish uchun quyida tavsiflangan boshqa usullar qo'llaniladi. Organoidlar zichligidagi farqlarga asoslangan bu usullar doimiy yoki bosqichma-bosqich zichlik gradienti bo'lgan eritmalarda santrifüjlashni amalga oshirish orqali yanada samarali ajratishni ta'minlaydi. Ushbu usullarning kamchiligi shundaki, eritma zichligi gradientini olish uchun vaqt kerak bo'ladi.
2.2 Zonali tezlikda santrifüjlash
Zonal-tezlik usuli yoki, shuningdek, deyilganidek,s-zonal sentrifugalash sinov namunasini doimiy zichlik gradienti bo‘lgan eritma yuzasiga qatlamlashdan iborat. Keyin zarrachalar diskret zonalar yoki chiziqlar bo'ylab gradient bo'ylab taqsimlanmaguncha namuna santrifüj qilinadi. Zichlik gradientini yaratish orqali konveksiya natijasida yuzaga keladigan zonalarning aralashishiga yo'l qo'yilmaydi. Tezlik zonasi santrifüjlash usuli RNK-DNK gibridlarini, ribosoma bo'linmalarini va boshqa hujayrali komponentlarni ajratish uchun ishlatiladi.
Guruch. 2 .4. Zichlik gradientida zarrachalarning tezligi va izopiknal ajralishi. Santrifüjlash boshlanishidan oldin zarracha suspenziyasi suyuqlik zichligi gradienti ustiga qatlamlanadi. (A). Yuqori tezlikda santrifüjlashda zarralar izopiknal nuqtaga etib bormaydi, izopiknal ajratish bilan esa, o'rganilayotgan zarrachalar tegishli zichlikka ega bo'lgan zonaga yetguncha sentrifugalash davom ettiriladi. (b).
2.3 Izopiknik santrifugalash
Izopiknik santrifüjlash ham zichlik gradientida, ham odatdagi usulda amalga oshiriladi. Agar sentrifugalash zichlik gradientida amalga oshirilmasa, avvalo preparat sentrifugalanadi, shunda molekulyar og'irligi o'rganilayotgan zarrachalarnikidan kattaroq bo'lgan zarralar cho'kadi. Ushbu og'ir zarralar tashlanadi va namuna zichligi izolyatsiya qilinadigan fraktsiya bilan bir xil bo'lgan muhitda to'xtatiladi, so'ngra qiziq zarralar naycha tubiga joylashguncha va pastroq zichlikdagi zarralar suzmaguncha santrifüj qilinadi. suyuqlik yuzasi ..
Guruch. 2.5. Zichlik gradientisiz izopiknal ajratish.
Santrifüjdan oldin zarralar santrifüj naychasining hajmi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi. (A). Santrifüjdan so'ng, engilroq zarralar yuqoriga suzib, og'irroq zarralar esa naychaning pastki qismiga joylashadi. (b)
Yana bir usul - namunani eritma yuzasiga aralashmaning barcha tarkibiy qismlarining zichlik oralig'ini qamrab oladigan doimiy zichlik gradienti bilan qatlamlashdir. Santrifüjlash zarrachalarning suzuvchi zichligi mos keladigan zonalarning zichligiga teng bo'lgunga qadar, ya'ni zarralar zonalarga ajratilguncha amalga oshiriladi. Usul zonal-izopiknal yoki rezonansli santrifüj deb ataladi, chunki bu erda asosiy nuqta zarrachalarning o'lchami yoki shakli emas, balki suzuvchi zichlikdir. Zarrachalarning izopiknal chiziqlar hosil qilish zichligiga suspenziya muhitining tabiati ta'sir qiladi; zarralar eritmadagi ba'zi birikmalar uchun o'tkazuvchan va boshqalarni o'tkazmaydigan bo'lishi mumkin yoki ular eritma molekulalarini biriktirishi mumkin. Zonali rotordan foydalanganda mitoxondriyalar, lizosomalar, peroksizomalar va mikrosomalar 1,18, 1,21, 1,21 va 1,10 g-sm zichlikka mos keladigan 42%, 47%, 47% va 27% saxaroza bo'lgan tasmalarda to'planadi.-3 mos ravishda. Hujayra osti organellalarining zichligi ularning ma'lum birikmalarni tanlab singishiga ham bog'liq. Gemolitik bo'lmagan detarjen Tritonni kalamushlarga yuborishWR-1339 jigar lizosomalari hajmining oshishiga va zichligining pasayishiga olib keladi; mitoxondriya va peroksizomalarning zichligi o'zgarishsiz qoladi. Lizosomalarning sedimentatsiya xususiyatlari, qoida tariqasida, o'zgarmasligiga qaramay, ularning saxaroza gradientidagi muvozanat zichligi 1,21 dan 1,1 gacha kamayadi, bu esa lizosomal-peroksisomal fraktsiyaning mos ravishda ajralishiga olib keladi. Bu xususiyat lizosomalarni, mitoxondriyalarni va peroksisomalarni miqdoriy ajratishda, mikrosomalarnikidan kattaroq zichlikka ega bo'lgan barcha zarrachalarni bir hil muhitdan olib tashlash va keyinchalik cho'kma og'ir zarrachalarni izopiknal sentrifugalash asosida qo'llaniladi.
2.4 Muvozanat zichligi gradienti sentrifugalash
Zichlik gradientini yaratish uchun og'ir metallarning tuzlari, masalan, rubidiy yoki seziy, shuningdek, sukroz eritmalari ishlatiladi. Namuna, masalan, DNK, seziy xloridning konsentrlangan eritmasi bilan aralashtiriladi. Eriydigan modda ham, erituvchi ham dastlab butun hajmda bir tekis taqsimlanadi. Santrifüjlash jarayonida konsentratsiyaning muvozanat taqsimoti va shuning uchun zichlik o'rnatiladiCsCl, chunki seziy ionlari katta massaga ega. Santrifüj tezlashuvi ta'sirida DNK molekulalari qayta taqsimlanadi, tegishli zichlikka ega bo'lgan probirkaning bir qismida alohida zona shaklida to'planadi. Usul asosan analitik sentrifugalashda qo'llaniladi va Meselson va Stahl tomonidan DNK replikatsiyasi mexanizmini o'rganish uchun ishlatilgan.E. coli . Muvozanat zichligi gradienti santrifüjlash ham inson qon plazmasidagi lipoproteinlarni ajratish va o'rganish usullaridan biridir.
2. 5 Gradientlarni yaratish va chiqarish
2.5.1 Gradientlarning tabiati
Eritmalarda zichlik gradientlarini yaratish uchun saxaroza eritmalari ko'pincha ishlatiladi, ba'zan esa belgilangan pH bilan. Ba'zi hollarda oddiy suv o'rniga ishlatilganda yaxshi ajralish olinadiD2 0. Jadvalda. 2.1-jadvalda ba'zi saxaroza eritmalarining xossalari keltirilgan.
Diqqat, %
Saxaroza eritmalarining xossalari
Gradientni tanlash aniq fraksiyalash maqsadlari bilan belgilanadi. Masalan, kompaniya tomonidan ishlab chiqarilgan fikolDorixona Yaxshi Kimyoviy moddalar, yuqori zichlikli va past osmotik bosimga ega bo'lgan gradyanlarni yaratish zarur bo'lgan hollarda sukrozni almashtirishi mumkin. Fikolning yana bir afzalligi shundaki, u hujayra membranalaridan o'tmaydi. Yuqori zichlikdagi gradientlarni yaratish uchun rubidiy va seziy kabi og'ir metallarning tuzlari ishlatiladi, ammo korroziy ta'sir tufayliCsClBunday gradientlar faqat titan kabi chidamli metallardan yasalgan rotorlarda qo'llaniladi.
2.5.2 Bosqichli zichlik gradientini yaratish usuli
Zichlik gradientini yaratish uchun zichligi ketma-ket pasaygan bir nechta eritmalar diqqat bilan santrifüj trubkasiga pipetlanadi. Keyin namuna eng past zichlikka ega bo'lgan eng yuqori qatlamga tor zona shaklida qatlamlanadi, shundan so'ng trubka santrifüj qilinadi. Silliq chiziqli gradientlarni eritma uzoq vaqt turganda qadam gradientlarini tekislash orqali olish mumkin. Naychaning tarkibini tel bilan muloyimlik bilan aralashtirish yoki naychani muloyimlik bilan silkitish orqali jarayonni tezlashtirish mumkin.
2.5.3 Silliq zichlik gradientini yaratish usuli
Ko'pgina hollarda, silliq zichlik gradientini yaratish uchun maxsus qurilma ishlatiladi. U qat'iy belgilangan bir xil diametrli ikkita silindrsimon tomirlardan iborat bo'lib, ular pastki qismida nazorat valfi bo'lgan shisha trubka yordamida bir-biri bilan aloqa qiladi, bu ikkala idishning tarkibini aralashtirish nisbatlarini tartibga solish imkonini beradi. Ulardan biri aralashtirgich bilan jihozlangan va eritma sentrifuga naychalariga oqib o'tadigan chiqish joyiga ega. Zichroq eritma mikserga joylashtiriladi; ikkinchi tsilindr pastroq zichlikdagi eritma bilan to'ldiriladi. Ikkala tsilindrdagi eritma ustunining balandligi ulardagi gidrostatik bosim bir xil bo'lishi uchun o'rnatiladi. Zichroq eritma mikserdan asta-sekin santrifüj naychalariga chiqariladi va bir vaqtning o'zida nazorat valfi orqali ikkinchi tsilindrdan mikserga kiradigan past zichlikdagi eritmaning teng hajmi bilan almashtiriladi. Aralashtirgichdagi eritmaning bir xilligi eritmani aralashtirgich yordamida doimo aralashtirish orqali ta'minlanadi. Eritma sentrifuga naychalariga quyilganda uning zichligi pasayadi va quvurlarda chiziqli zichlik gradienti hosil bo'ladi. Nonchiziqli gradientlar teng bo'lmagan diametrli ikkita silindrdan iborat tizim yordamida yaratilishi mumkin.
Har xil tiklikdagi zichlik gradientlarini hosil qilish uchun teng bo'lmagan zichlikdagi eritmalar bilan to'ldirilgan ikkita mexanik boshqariladigan shpritslar tizimi qo'llaniladi. Pistonlarning nisbiy tezligini o'zgartirish orqali turli xil gradyanlar yaratilishi mumkin.
2.5.4 Santrifuga naychalaridan gradientlarni olib tashlash
Santrifüj va zarrachalarni ajratish tugallangandan so'ng, hosil bo'lgan zonalarni olib tashlash kerak. Bu bir necha usulda, ko'pincha joy almashtirish orqali amalga oshiriladi. Santrifüj trubkasi tagida teshiladi va uning pastki qismiga juda zich muhit, masalan, 60-70% saxaroza eritmasi asta-sekin kiritiladi. Yuqoridagi eritma siljiydi va fraktsiyalar shprits, pipetka yoki naycha orqali fraksiya kollektoriga ulangan maxsus qurilma yordamida yig'iladi. Agar naychalar tsellyuloid yoki nitroselülozdan tayyorlangan bo'lsa, fraktsiyalar naychani maxsus pichoq bilan kesish orqali chiqariladi. Buning uchun stendga mahkamlangan santrifüj trubkasi to'g'ridan-to'g'ri kerakli maydon ostidan kesiladi va fraksiya shprits yoki pipetka bilan so'riladi. Kesish moslamasining mos dizayni bilan eritmaning yo'qolishi minimal bo'ladi. Fraksiyalar, shuningdek, ingichka ichi bo'sh igna bilan naychaning asosini teshish orqali yig'iladi. Naychadan igna orqali oqadigan tomchilar keyingi tahlil qilish uchun fraksiya kollektorida yig'iladi.
2.5.5 Preparat sentrifugalari va ularning qo'llanilishi
Preparatli sentrifugalarni uchta asosiy guruhga bo'lish mumkin: umumiy maqsadli sentrifugalar, yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar va preparativ ultratsentrifugalar.Umumiy maqsadli sentrifugalar 6000 rpm maksimal tezlikni bering-1 va OCU 6000 gachag . Ular bir-biridan faqat quvvati bilan farq qiladi va bir qator almashtiriladigan rotorlarga ega: burchakli va osilgan stakan bilan. Ushbu turdagi sentrifugalarning xususiyatlaridan biri uning katta sig'imi - 4 dan 6 dm gacha3 , bu ularni nafaqat 10,50 va 100 sm bo'lgan santrifüj naychalari bilan yuklash imkonini beradi.3 , balki sig'imi 1,25 dm gacha bo'lgan idishlar ham3 . Ushbu turdagi barcha sentrifugalarda rotorlar qo'zg'aysan miliga qattiq o'rnatilgan bo'lib, santrifüj naychalari tarkibi bilan birga ehtiyotkorlik bilan muvozanatlangan bo'lishi va og'irligi 0,25 g dan oshmasligi kerak.Turbalarning toq soni bo'lmasligi kerak. rotorga yuklangan va agar rotor to'liq yuklanmagan bo'lsa, quvurlar nosimmetrik tarzda bir-biriga qarama-qarshi joylashtirilishi kerak, bu esa rotorning aylanish o'qiga nisbatan quvurlarning teng taqsimlanishini ta'minlaydi.
Yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar 25000 rpm maksimal tezlikni bering-1 va OCU 89000 gachag. Rotor kamerasi rotor aylanayotganda ishqalanish tufayli yuzaga keladigan issiqlikni oldini oluvchi sovutish tizimi bilan jihozlangan. Odatda, yuqori tezlikda ishlaydigan sentrifugalar 1,5 dm3 sig'imga ega3 va burchakli va osilgan chashka bilan almashtiriladigan rotorlar bilan jihozlangan.
Tayyorlovchi ultratsentrifugalar 75 000 rpm gacha bo'lgan maksimal tezlikni bering-1 va maksimal markazdan qochma tezlashuvi 510 000g . Havo bilan ishqalanish tufayli rotorning haddan tashqari qizib ketishiga yo'l qo'ymaslik uchun ular sovutgich va vakuum birligi bilan jihozlangan. Bunday sentrifugalarning rotorlari yuqori quvvatli alyuminiy yoki titanium qotishmalaridan tayyorlanadi. Alyuminiy qotishmalaridan tayyorlangan rotorlar asosan ishlatiladi, lekin ayniqsa yuqori tezlik talab qilinadigan hollarda titandan tayyorlangan rotorlar qo'llaniladi. Santrifüj naychalarining notekis to'ldirilishi tufayli rotor muvozanatining buzilishidan kelib chiqadigan tebranishlarni kamaytirish uchun ultratsentrifugalar egiluvchan milga ega. Santrifüj naychalari va ularning tarkibini 0,1 g gacha ehtiyotkorlik bilan muvozanatlash kerak.Umumiy maqsadli santrifugalarning rotorlarini yuklashda shunga o'xshash talablarga rioya qilish kerak.
2.6 Rotor dizayni
2.6.1 Burchakli rotorlar va osilgan kosalar bilan rotorlar
Tayyor santrifüj rotorlari odatda ikki xil bo'ladi - burchakli va osilgan kosali. Ular burchakli deb ataladi, chunki ularda joylashgan santrifüj naychalari doimo aylanish o'qiga ma'lum bir burchak ostida bo'ladi. Stakan osilgan rotorlarda probirkalar vertikal ravishda o'rnatiladi va hosil bo'lgan markazdan qochma kuch ta'sirida aylantirilganda ular gorizontal holatga o'tadi; aylanish o'qiga moyillik burchagi 90 ° ga teng.
To'g'ri burchakli rotorlarda zarrachalarning probirkaning mos devorigacha bo'lgan masofasi juda kichik va shuning uchun cho'kish nisbatan tez sodir bo'ladi. Probirkaning devorlari bilan to'qnashgandan so'ng, zarrachalar pastga siljiydi va pastki qismida cho'kindi hosil qiladi. Santrifüjlash paytida konveksiya oqimlari paydo bo'ladi, bu esa o'xshash cho'kindi xususiyatlariga ega bo'lgan zarrachalarni ajratishni ancha murakkablashtiradi. Shunga qaramay, shunga o'xshash dizayndagi rotorlar cho'kish tezligi sezilarli darajada farq qiladigan zarralarni ajratish uchun muvaffaqiyatli qo'llaniladi.
To'xtatilgan stakanli rotorlarda konveksiya hodisalari ham kuzatiladi, ammo ular unchalik aniq emas. Konvektsiya markazdan qochma tezlanish ta'sirida zarrachalarning aylanish o'qiga qat'iy perpendikulyar bo'lmagan yo'nalishda joylashishi va shuning uchun burchakli rotorlarda bo'lgani kabi, ular probirkaning devorlariga urilib, probirkaga siljishi natijasidir. pastki.
Konvektsiya va vorteks ta'siridan ma'lum darajada osilgan idish rotorlarida sektorli quvurlardan foydalanish va rotor tezligini sozlash orqali oldini olish mumkin; Zichlik gradienti santrifüjlash usuli ham yuqorida sanab o'tilgan kamchiliklarga ega emas.
2.6.2 Uzluksiz rotorlar
Uzluksiz rotorlar katta hajmli suspenziyalardan nisbatan kichik miqdordagi qattiq materialni yuqori tezlikda fraksiyalash uchun mo'ljallangan, masalan, hujayralarni madaniy muhitdan ajratish uchun. Santrifüj paytida rotorga zarrachalarning suspenziyasi doimiy ravishda qo'shiladi; Rotorning sig'imi yotqizilgan mahsulotning tabiatiga bog'liq va 100 sm dan farq qiladi3 1 dm gacha3 1 daqiqada Rotorning o'ziga xos xususiyati shundaki, u maxsus dizayndagi izolyatsiya qilingan kameradir; uning tarkibi tashqi muhit bilan aloqa qilmaydi va shuning uchun ifloslanmaydi yoki tarqalmaydi.
2.6.3 Zona rotorlari yoki Anderson rotorlari
Guruch. 2 .6. Santrifüj bosqichlari (a- e) zonali rotorda
Zonal rotorlar alyuminiy yoki titanium qotishmalaridan tayyorlangan bo'lib, ular juda muhim markazdan qochma tezlashuvlarga bardosh berishga qodir. Ular odatda olinadigan qopqoq bilan yopilgan silindrsimon bo'shliqqa ega. Bo'shliqning ichida, aylanish o'qida, rotor bo'shlig'ini to'rtta sektorga bo'ladigan pichoqlari bo'lgan nozul o'rnatilgan eksenel trubka mavjud. Pichoqlar yoki to'siqlar radial kanallarga ega bo'lib, ular orqali eksenel trubadan rotorning chetiga gradient majburlanadi. Pichoqlarning bunday dizayni tufayli konveksiya minimal darajaga tushiriladi.
Rotor taxminan 3000 rpm tezlikda aylanganda to'ldiriladi-1 . Oldindan yaratilgan gradient rotorga eng past zichlikdagi qatlamdan boshlab pompalanadi, u rotorning periferiyasi bo'ylab teng ravishda taqsimlanadi va markazdan qochma kuch tufayli uning tashqi devorida aylanish o'qiga perpendikulyar bo'ladi.. Keyinchalik yuqori zichlikdagi gradient qatlamlari qo'shilganda, kamroq zich qatlamlar markaziga doimiy siljish mavjud. Rotorga butun gradient pompalangandan so'ng, u "yostiq" deb nomlangan eritma bilan to'liq hajmga to'ldiriladi, uning zichligi oldindan tuzilgan gradientning eng yuqori zichligiga mos keladi yoki biroz oshadi.
Keyin eksenel trubka orqali sinov namunasi qatlamlanadi, pastki zichlikdagi eritma yordamida trubadan rotor hajmiga majburan chiqariladi, bu holda, "yostiq" ning bir xil hajmi periferiyadan chiqariladi. Ushbu protseduralarning barchasidan so'ng, rotorning aylanish tezligi ish tezligiga keltiriladi va kerakli vaqt oralig'ida zonal tezlik yoki zonal-izopik fraksiyalash amalga oshiriladi.. Fraksiyalarni chiqarish 3000 rpm rotor tezligida amalga oshiriladi-1 . Rotorning tarkibi chetdan "yostiq" qo'shilishi bilan almashtiriladi; birinchi navbatda kamroq zich qatlamlar siljiydi.. Anderson rotorining eksenel kanalining maxsus dizayni tufayli, ular joy o'zgartirilganda zonalarni aralashtirish sodir bo'lmaydi. Chiqish gradienti yozib olish moslamasi, masalan, spektrofotometrning hujayrasi orqali o'tkaziladi, uning yordamida oqsil tarkibini 280 nm yutilish orqali yoki maxsus radioaktivlik detektori orqali aniqlash mumkin, shundan so'ng fraktsiyalar yig'iladi.
O'rtacha tezlikda ishlatiladigan zonal rotorlarning quvvati 650 dan 1600 sm gacha o'zgarib turadi3 , bu sizga juda katta miqdordagi materialni olish imkonini beradi. Zona rotorlari turli preparatlardan oqsil aralashmalarini olib tashlash va mitoxondriyalarni, lizosomalarni, polisomalarni va oqsillarni ajratish va tozalash uchun ishlatiladi.
2.6.4 Hujayra osti fraksiyalarini tahlil qilish
Preparatni fraksiyalash jarayonida olingan hujayra osti zarrachalarining xossalari, agar preparat tarkibida aralashmalar bo'lmasa, zarrachalarning o'ziga xos xususiyatlariga bog'liq bo'lishi mumkin. Shuning uchun, natijada olingan preparatlarning tozaligini har doim baholash kerak. Gomogenizatsiya samaradorligi va preparatdagi aralashmalarning mavjudligi mikroskopik tekshirish yordamida aniqlanishi mumkin. Biroq, ko'rinadigan aralashmalarning yo'qligi hali preparatning tozaligining ishonchli dalili emas. Sofligini aniqlash uchun olingan preparat kimyoviy tahlildan o'tkaziladi, bu uning oqsil yoki DNK tarkibini, iloji bo'lsa, fermentativ faolligini va immunologik xususiyatlarini aniqlash imkonini beradi.
Fraksiyalangan to'qimalarda fermentlarning tarqalishini tahlil qilish ikkita umumiy tamoyilga asoslanadi. Ulardan birinchisi, ma'lum bir hujayra osti populyatsiyasining barcha zarralari bir xil fermentlar to'plamini o'z ichiga oladi. Ikkinchisi, har bir ferment hujayra ichidagi ma'lum bir joyda lokalizatsiya qilinganligini taxmin qiladi. Agar bu pozitsiya to'g'ri bo'lsa, fermentlar mos keladigan organellalar uchun marker bo'lishi mumkin edi: masalan, sitoxrom oksidaza va monoamin oksidaza mitoxondriya uchun marker fermenti, kislota gidrolazalari lizosomalar uchun marker, katalaza peroksisomalar uchun marker va glyukoza- 6-fosfataza - mikrosomal membranalarning belgisi. Ammo ma'lum bo'ldiki, ba'zi fermentlar, masalan, malatdehidrogenaza.R -glyukuronidaza, NADP'H-sitoxrom c-reduktaza bir nechta fraktsiyalarda lokalizatsiya qilingan. Shuning uchun har bir alohida holatda subcellular fraktsiyalar uchun ferment markerlarini tanlashga juda ehtiyotkorlik bilan yondashish kerak. Bundan tashqari, marker fermentining yo'qligi tegishli organellalarning yo'qligini anglatmaydi. Ehtimol, fraksiyalash paytida ferment organellalardan yo'qoladi yoki inhibe qilinadi yoki inaktivlanadi; shuning uchun har bir fraksiya uchun odatda kamida ikkita marker fermenti aniqlanadi.
Fraksiya
2.7 Differensial sentrifugalash orqali fraksiyalash
2.7.1 Natijalarni taqdim etish
To'qimalarni fraksiyalashdan olingan natijalar eng qulay tarzda grafiklar shaklida taqdim etiladi. Shunday qilib, fermentlarning to'qimalarda tarqalishini o'rganishda ma'lumotlar eng yaxshi gistogrammalar shaklida taqdim etiladi, bu esa tajribalar natijalarini vizual baholash imkonini beradi.
Namunadagi fermentativ faollikdagi oqsil miqdori asl gomogenatda ham, har bir ajratilgan hujayra osti fraksiyasida ham alohida aniqlanadi. Fraksiyalardagi umumiy fermentativ faollik va oqsil miqdori asl gomogenatdagi mos qiymatlardan unchalik farq qilmasligi kerak.
Keyin har bir fraksiyadagi fermentativ faollik va oqsil miqdori umumiy hosilning foizi sifatida hisoblanadi, uning asosida gistogramma tuziladi. Har bir fraksiyadagi oqsilning nisbiy miqdori ularning ajratilish tartibi bo‘yicha abscissa o‘qi bo‘ylab ketma-ket, har bir fraksiyaning nisbiy solishtirma faolligi esa ordinata o‘qi bo‘ylab chiziladi. Shunday qilib, har bir fraksiyaning fermentativ faolligi ustunlar maydoni bilan belgilanadi.
2.7.2 Analitik ultratsentrifugalash
Maqsadi moddalarni ajratish va ularni tozalashdan iborat preparativ sentrifugalashdan farqli o'laroq, analitik ultratsentrifugalash asosan biologik makromolekulalar va boshqa tuzilmalarning cho'ktirish xususiyatlarini o'rganish uchun ishlatiladi. Shuning uchun, analitik santrifüjlashda maxsus dizayndagi rotorlar va ro'yxatga olish tizimlari qo'llaniladi: ular materialning cho'kindi jinsini doimiy ravishda kuzatib borish imkonini beradi.V markazdan qochma maydon.
Analitik ultratsentrifugalar 70 000 rpm gacha tezlikka erisha oladi -1 , 500 000 gacha bo'lgan markazdan qochma tezlashuvni yaratishg . Ularning rotori, qoida tariqasida, ellipsoid shakliga ega va rotorning aylanish tezligini o'zgartirishga imkon beruvchi tor orqali dvigatelga ulanadi. Rotor sovutish moslamasi bilan jihozlangan vakuum kamerasida aylanadi va aylanish o'qiga parallel ravishda santrifüjda qat'iy vertikal ravishda o'rnatiladigan analitik va muvozanatlashtiruvchi ikkita hujayraga ega. Balanslash xujayrasi analitik hujayrani muvozanatlash uchun xizmat qiladi va aniq tizimga ega bo'lgan metall blokdir. Shuningdek, u aylanish o'qidan qat'iy belgilangan masofada joylashgan ikkita indeksli teshikka ega bo'lib, ular yordamida analitik katakdagi mos masofalar aniqlanadi. Imkoniyati odatda 1 sm bo'lgan analitik hujayra 3 , tarmoq shakliga ega. Rotorga to'g'ri o'rnatilganda, u vertikal holatda turishiga qaramay, u osilgan stakanli rotor bilan bir xil printsip asosida ishlaydi va deyarli ideal cho'kindi sharoitlarini yaratadi. Analitik hujayraning uchlarida kvarts oynali oynalar mavjud. Analitik ultratsentrifugalar butun sentrifugalash davrida zarrachalar cho'kindiligini kuzatish imkonini beruvchi optik tizimlar bilan jihozlangan. Belgilangan vaqt oralig'ida cho'kindi materialni suratga olish mumkin. Oqsillar va DNKlarni fraksiyalashda cho'kindilanish ultrabinafsha nurda yutilish orqali va o'rganilayotgan eritmalar turli xil sinishi ko'rsatkichlariga ega bo'lgan hollarda - Schlieren tizimi yoki Rayleigh interferentsiya tizimi yordamida nazorat qilinadi. Oxirgi ikkita usul yorug'lik turli zichlikdagi zonalardan tashkil topgan shaffof eritmadan o'tganda, zonalar chegarasida yorug'lik sinishi sodir bo'lishiga asoslanadi. Cho'kish paytida og'ir va engil zarralar bo'lgan zonalar o'rtasida chegara hosil bo'lib, u sindiruvchi linza vazifasini bajaradi; bu holda detektor sifatida ishlatiladigan fotografik plastinkada tepalik paydo bo'ladi. Cho'kish paytida chegara harakatlanadi va natijada cho'qqi, uning tezligi bo'yicha materialning cho'kish tezligini baholash mumkin. Interferometrik tizimlar shlieren tizimlariga qaraganda sezgirroq. Analitik hujayralar eng ko'p ishlatiladigan bir sektorli va erituvchi va erigan moddalarni qiyosiy o'rganish uchun ishlatiladigan ikki sektorli.
Biologiyada analitik ultratsentrifugalash makromolekulalarning molekulyar og'irliklarini aniqlash, olingan namunalarning tozaligini tekshirish, shuningdek, makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganish uchun ishlatiladi.
2.8 Analitik ultratsentrifugalashning qo'llanilishi
2.8.1 Molekulyar og'irliklarni aniqlash
Analitik ultratsentrifugalash yordamida molekulyar og'irliklarni aniqlashning uchta asosiy usuli mavjud: cho'kish tezligini aniqlash, cho'kma muvozanat usuli va cho'kma muvozanatini yaqinlashish usuli.
Sedimentatsiya tezligi bo'yicha molekulyar og'irlikni aniqlash - bu eng keng tarqalgan usul. Santrifüjlash yuqori tezlikda amalga oshiriladi, shunda dastlab butun hajm bo'ylab bir tekis taqsimlangan zarralar aylanish markazidan radius bo'ylab tartibli harakatlana boshlaydi. Erituvchining allaqachon zarralardan xoli bo'lgan hududi va ularni o'z ichiga olgan qism o'rtasida aniq interfeys hosil bo'ladi. Bu chegara sentrifugalash vaqtida harakatlanadi, bu esa yuqoridagi usullardan biri yordamida zarrachalarning cho`kish tezligini aniqlash, bu harakatni fotoplastinkaga yozib olish imkonini beradi.
Sedimentatsiya tezligi quyidagi bog'liqlik bilan belgilanadi:
QayerdaX - aylanish o'qidan masofa sm,
t - s da vaqt,
w- rad-s da burchak tezligi -1 ,
s - “molekulaning cho‘ktirish koeffitsienti.
Cho'kish koeffitsienti - bu tezlashuv birligining tezligi, u bilan o'lchanadiSeedberg birliklari ; 1 Svedberg birligi 10 ga teng _13 Bilan. Raqamli qiymatszarrachalarning molekulyar og'irligi va shakliga bog'liq bo'lib, berilgan molekula yoki supramolekulyar tuzilishga xos bo'lgan qiymatdir. Masalan, lizozimning sedimentatsiya koeffitsienti 2,15 ga tengS; katal aza 11,35 sedimentatsiya koeffitsientiga egaS, bakterial ribosomalarning subbirliklari - 30 dan 50 gachaS, va eukaryotik ribosoma bo'linmalari - 40 dan 60S gacha.
QayerdaM - molekulaning molekulyar og'irligi,R - gaz doimiyligi,T - mutlaq harorat;s- molekula cho'kindi koeffitsienti,D - molekulaning diffuziya koeffitsienti,v - bir gramm erigan moddaning egallagan hajmi deb hisoblanishi mumkin bo'lgan qisman solishtirma hajm, p - erituvchining zichligi.
Sedimentatsiyaning muvozanat usuli. Ushbu usul bilan molekulyar og'irliklarni aniqlash rotorning nisbatan past tezligida, taxminan 7000-8000 rpm tezlikda amalga oshiriladi. -1 shuning uchun yuqori molekulyar og'irlikdagi molekulalar tubiga cho'kmaydi. Ultratsentrifugalash bir tomondan markazdan qochma kuchlar, ikkinchi tomondan diffuziya kuchlari taʼsirida oʻrnatiladigan zarrachalar muvozanat holatiga kelguncha, yaʼni zarrachalar harakati toʻxtaguncha amalga oshiriladi. Keyin hosil bo'lgan kontsentratsiya gradientidan moddaning molekulyar og'irligi formula bo'yicha hisoblanadi
QayerdaR - gaz doimiyligi,T - mutlaq harorat, ō - burchak tezligi, p - erituvchi zichligi,v - qisman o'ziga xos hajm;Bilan X VaBilan 2 - masofadagi eritma konsentratsiyasiG G va g 2 aylanish o'qidan.
Ushbu usulning nochorligi shundaki, cho'kma muvozanatiga erishish uchun u uzoq vaqt talab etadi - sentrifuganing uzluksiz ishlashi bilan bir necha kundan bir necha haftagacha.
Sedimentatsiya muvozanatiga yaqinlashish usuli edi muvozanatni o'rnatish uchun zarur bo'lgan katta vaqt bilan bog'liq bo'lgan oldingi usulning kamchiliklaridan xalos bo'lish maqsadida ishlab chiqilgan. Bu usul yordamida sentrifugalangan eritma muvozanat holatiga yaqin bo‘lganda molekulyar og‘irliklarni aniqlash mumkin. Dastlab, makromolekulalar analitik hujayraning butun hajmi bo'ylab bir tekis taqsimlanadi; keyin santrifüjlash davom etar ekan, molekulalar joylashadi va menisk mintaqasidagi eritmaning zichligi asta-sekin kamayadi. Zichlikning o'zgarishi diqqat bilan qayd etiladi, so'ngra ko'p sonli o'zgaruvchilarni o'z ichiga olgan murakkab hisob-kitoblar orqali ma'lum birikmaning molekulyar og'irligi formulalar yordamida aniqlanadi:
QayerdaR - gaz doimiyligi,T - mutlaq harorat;v - qisman solishtirma hajmi, p - erituvchi zichligi,dcldr - makromolekulyar konsentratsiya gradienti, g mva g d- mos ravishda menisk va probirkaning pastki qismigacha bo'lgan masofa, s mva bilan d- mos ravishda meniskda va probirkaning pastki qismida makromolekulalar konsentratsiyasi;M m VaM R - mos ravishda menisk va probirkaning pastki qismidagi modda kontsentratsiyasining taqsimlanishidan aniqlangan molekulyar og'irlik qiymatlari.
2.8.2 Dori vositalarining tozaligini baholash
Analitik ultratsentrifugalash DNK, virus va oqsil preparatlarining tozaligini baholash uchun keng qo'llaniladi. Preparatlarning tozaligi, shubhasiz, molekulaning molekulyar og'irligini aniq aniqlash zarur bo'lgan hollarda juda muhimdir. Ko'pgina hollarda preparatning bir jinsliligini cho'kindilanish chegarasining tabiatiga ko'ra, cho'kish tezligini aniqlash usuli yordamida baholash mumkin: bir hil preparat odatda bitta aniq chegarani beradi. Preparatda mavjud bo'lgan nopokliklar qo'shimcha tepalik yoki elka sifatida paydo bo'ladi; ular asosiy tepalikning assimetriyasini ham aniqlaydilar.
2.8.3 Makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganish
Analitik ultratsentrifugalashni qo'llashning yana bir sohasi makromolekulalardagi konformatsion o'zgarishlarni o'rganishdir. Masalan, DNK molekulasi bir yoki ikki zanjirli, chiziqli yoki aylana bo'lishi mumkin. Turli birikmalar ta'sirida yoki yuqori haroratda DNK bir qator qaytar va qaytarilmas konformatsion o'zgarishlarga uchraydi, ularni namunaning cho'kish tezligining o'zgarishi bilan aniqlash mumkin. Molekula qanchalik ixcham bo'lsa, uning eritmadagi ishqalanish koeffitsienti shunchalik past bo'ladi va aksincha: u qanchalik ixcham bo'lsa, ishqalanish koeffitsienti shunchalik katta bo'ladi va shuning uchun u sekinroq cho'kadi. Shunday qilib, namunaga turli xil ta'sirlardan oldin va keyin cho'kish tezligidagi farqlar makromolekulalarda sodir bo'ladigan konformatsion o'zgarishlarni aniqlash imkonini beradi.
Aspartat transkarbamoylaza kabi allosterik oqsillarda konformatsion o'zgarishlar ularning substrat va kichik ligandlar bilan bog'lanishi natijasida yuzaga keladi. Proteinning subbirliklarga ajralishi uni karbamid yoki paraxloromerkuribenzoat kabi moddalar bilan davolash natijasida yuzaga kelishi mumkin. Ushbu o'zgarishlarning barchasini analitik ultratsentrifugalash yordamida osongina kuzatish mumkin.